[发明专利]一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法。

背景技术

干扰素（英文名称为interferon，简称为IFN）是一种由人体细胞分泌的在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性,其活性发挥受细胞基因组的调节和控制并涉及RNA和蛋白质的合成。

目前，干扰素是应用广泛且临床效果显著的治疗性药物，其广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，在病毒性疾病治疗中有不可取代的作用，但普通干扰素用于临床治疗时，通常为胃肠外给药，体内药物代谢的半衰期短,免疫原性强，导致给药间隔短，给药频度高，人体内产生抗体也导致药效降低，难以达到较理想的临床效果。近年来，聚乙二醇修饰技术有效地解决了蛋白质药物的此类缺陷。聚乙二醇（英文名称为interferon，简称为PEG)是一种惰性无毒、可生物降解的有机多聚物，在生物技术和制药领域有着广泛的用途，聚乙二醇修饰技术就是通过共价结合将聚乙二醇连接到活性蛋白质上，蛋白质药物经聚乙二醇化后，空间结构发生改变。聚乙二醇具有空间位阻，将蛋白质表面的抗原决定簇掩盖起来，使蛋白质分子不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，抑制相应的免疫反应。另外，蛋白质化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。

蛋白质药物的聚乙二醇化已经成为蛋白类药物的发展方向，虽然通过聚乙二醇对蛋白质药物进行修饰可以获得种种优点，但是蛋白质药物修饰是一个复杂的过程，很多因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。包括修饰剂的选择、修饰反应的条件、修饰后是否易于分离、纯化等等。因此对某一种药物而言, 有必要建立其聚乙二醇修饰的最优化方法。现有技术中对干扰素的聚乙二醇修饰，反应后目标产物的回收率较低，成本较高，很难广泛地进行临床应用。

因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，通过优化聚乙二醇修饰蛋白质的偶联条件,包括pH、温度、反应介质、反应物配比等,提高偶联效率，易于后续产物的分离纯化，降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：

A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；

B、将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。

所述的偶联方法，其中，在所述步骤A之前还包括：将重组人干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。

所述的偶联方法，其中，所述步骤A具体的包括：

将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2℃-8℃的乙腈溶液中，使其终浓度为40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2-8倍；所述偶联反应在碱性条件下进行。

所述的偶联方法，其中，所述步骤B具体的包括：以2-6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM -80mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素。