[发明专利]火木层孔菌中3’,4’-二羟基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用

权利要求书

1.3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。

2.如权利要求1所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于3',4'-二羟基苯乙酮是从火木层孔菌提取的，提取步骤顺序如下：

(1)制备火木层孔菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌；

(3)对上述步骤（2）后制备的原料进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2至5次，得到洗脱液；

(4)将步骤（3）中的最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；

(5)收集步骤（4）的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(6)对步骤（5）得到的产物进行常压反相柱层析，使用洗脱剂洗脱；

(7)收集步骤（6）得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，得到3',4'-二羟基苯乙酮。

3.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液；

(2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(3)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；

(4)对步骤(3)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

4.如权利要求3所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%。

5.如权利要求3所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于火木层孔菌粗提物制备步骤（3）的乙醇为浓度65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。

6.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(2)中所述的硅胶为100-200目正相硅胶。

7.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(3)中所述的硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。

8.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(4)中所述的硅胶用量为1-3倍体积，洗脱剂为氯仿。

9.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(5)中所述的凝胶为Sephadex LH-20，洗脱剂为甲醇或丙酮。

10.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(6)所述的反相硅胶为反相C-8、C-18，洗脱剂为甲醇。

11.如权利要求2所述的3',4'-二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，提取步骤(7)中TLC检测要点是出现红色斑点，展开剂为氯仿：甲醇=30：1-40：1。