[发明专利]火木层孔菌中3’,4’-二羟基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感病毒H5N1的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及到的火木层孔菌菌株，已于2013 年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 保藏编号为CGMCC No.8108，生物样品分类名称为火木层孔菌 Phellinus igniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

背景技术

火木层孔菌，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱，边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质，菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝，管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个，孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米，刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米，菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。 

苯乙酮是一种无色晶体，或浅黄色油状液体，有山楂的气味。熔点20.5℃，沸点202.3℃，密度（20/4℃）1.0281g/cm3。微溶于水，易溶于多种有机溶剂。能与蒸气一起挥发，氧化时可以生成苯甲酸；还原时可生成乙苯，完全加氢时生成乙基环己烷。用于制香皂和香烟，也用作纤维素酯和树脂等的溶剂和塑料工业生产中的增塑剂等。可由苯与乙酸酐反应制得，或由乙苯氧化制得，也可用乙酰氯与苯在三氯化铝作用下经傅氏反应制得。 

    3',4'-二羟基苯乙酮的抗菌活性已经被证实，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。 

发明内容

本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的3',4'-二羟基苯乙酮。本发明首次公开了3',4'-二羟基苯乙酮的一种新活性，测定了其对MDCK细胞的最大无毒浓度，证明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。 

本发明的技术方案如下： 

首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉    1-5%             葡萄糖      1-5%

蛋白胨     0.1-0.5%          酵母膏     0.1-0.5%

硫酸镁     0.1-0.5%          磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5； 

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

然后从火木层孔菌粗提物中制备3',4'-二羟基苯乙酮，步骤如下：火木层孔菌粗提物→乙醇沉淀→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→TLC检测→减压蒸干→无色油状物（3',4'-二羟基苯乙酮）。 

具体方法为： 

(1)制备火木层孔菌菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌；

(3)对上述步骤（2）后制备的原料进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2至5次，得到洗脱液；

(4)将步骤（3）中的最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；