[发明专利]一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种胶原蛋白生物海绵的制备方法及其所制备的生物海绵。

背景技术

目前常用的胶原蛋白是从猪皮、牛皮、牛骨、鱼皮、鱼鳞等动物组织中提取而得，分子量不确定、分布范围广，且存在动物病毒隐患、应用于人体时又会产生异体或异种的排异反应等缺点和不足。本发明人的前期研究克服了这一缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。重组人源胶原蛋白是基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y（甘氨酸-X-Y）的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，通过一系列体外酶切连接，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，转入巴氏毕赤酵母菌，通过高密度发酵和分离、纯化而得。

具备网状多孔结构的胶原生物海绵是组织工程中重要的基质材料，可以模拟细胞外基质，利于细胞粘附和渗透，指引细胞分化和增殖以形成功能性目标组织，且对所负载药物具有缓释作用，从而在模拟细胞体内生长环境、建立体外细胞培养模型或者促进创伤的填充、修复、再生方面具有重要应用价值。 

利用原花青素作为交联剂，有助于提高胶原蛋白与壳聚糖共聚海绵（或支架、膜）的机械性能，即将胶原蛋白和壳聚糖共溶于酸性溶液中，加入原花青素进行交联反应，然后装入模具中成型，但是一般只能形成薄膜形状（参见：林旭明，等.原花青素交联的支架材料的生物相容性研究.眼科新进展.27(4):262；党美珠.天然多酚改性鱼鳞胶原蛋白-壳聚糖膜复合材料的制备及其应用研究.华中农业大学学位论文集，等）。

现有技术在生物海绵成型后，要么直接使用，要么于室温或高温干燥，如果其中需要去除利用制备生物海绵时引入的酸，加入氢氧化钠、氨等碱性物质来中和。然而，前者只能临时制备使用，不利于生物海绵的产业化推广应用；而经本发明研究发现，后者需要严格控制加入的原花青素的量，否则不利于生物海绵的机械性能。另外，通过加入碱性物质来中和，尽管pH值能达到生理要求，但是会使得生物海绵中残留有铵盐、钠盐等盐，影响其使用范围，在体内或者直接接触伤口的使用中受到了极大的限制。

本发明人经过长期研究，偶然发现了一种制备流程，先将胶原蛋白和壳聚糖冷冻干燥成型，再使用含乙醇的原花青素溶液来交联，水洗后再冷冻干燥。整个过程都可以使用目前的成熟设备，制备过程对原花青素浓度不敏感，成本投入少，而且能够提高生物海绵的机械性能（如能支撑起蓬松的块状而不溃缩），尤其是产品成型性好，完全依据模具成型，形成大小、尺寸、形状可控的海绵，尤其是能够形成  非薄膜状，另外在此流程中能够去除酸性物质，不留有铵盐、钠盐等盐残留，且易于保存，便于更广泛的产业化推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种新的重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法。另外，本发明还提供了由该方法制备的生物海绵。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种胶原蛋白生物海绵的制备方法，其包括：

（1）将含壳聚糖的酸性溶液加入到含胶原蛋白的酸性溶液中，混合均匀后，注入模具，低温冷冻成型；

（2）对步骤（1）的冷冻成型产物进行冷冻干燥，获得初级生物海绵；

（3）将步骤（2）获得的初级生物海绵浸泡入含原花青素的溶液中交联，然后用水洗涤； 

（4）对步骤（3）获得的洗涤产物进行冷冻干燥，获得胶原蛋白生物海绵；和，

（5）任选对胶原蛋白生物海绵进行剪裁。

在本文中，胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。例如，本发明的重组人源胶原蛋白可以是中国专利200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过专利公开号CN102443057A提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌（菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 5021）而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物（尤其是非哺乳动物）胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠，尽管机械强度会差一些。

   在本文中，低温是低于-10℃。通常利用液氮、干冰能够形成稳定的低温，当然市售的冰箱中有能够稳定维持-80℃的冰箱，也可以采用。所以，优选在本发明的第一方面的制备方法中，步骤（1）中的低温是-20~-195℃，优选是-20~-80℃，如-80℃。