[发明专利]一种基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非病毒阳离子载体的基因治疗组合物，更具体的说，涉及一种基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物及其制备方法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

近年来，肿瘤已经成为继心血管疾病之后威胁人类健康最严重的疾病之一。目前，肿瘤的常用治疗手段主要是手术治疗、放射治疗和化疗。这些手段虽然可以使患者获得较高的生存率，但术后复发及远处转移的问题仍然是困扰学者们的一大难题。随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对肿瘤发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。

对于成功的基因治疗，要求在机体内能有效安全地递送基因进入靶细胞。目前递送基因药物的载体主要有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体能够高效稳定递送基因药物，但是载体本身具有的免疫原性和潜在致突变性是临床使用病毒性载体递送基因药物的主要障碍。非病毒载体能很好地克服病毒载体的缺陷，但转染效率低，传递基因的表达效率低及体内循环时间较短。

Starburst PAMAM dendrimers是1985年由美国密西根化学研究所Donald.A.Tomalia等人首先合成的一类新型高分子聚合物。在生理条件下，PAMAM末端-NH2基团完全质子化成为带正电荷的-NH₃⁺，使分子表面具有很高的正电荷密度，能与基因发生静电相互作用形成复合物，并具有较高的转染率。但PAMAM作为基因递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决：1.PAMAM的高正电荷密度导致高毒性；2.在体内环境下，PAMAM可非特异性地结合大量的负电大分子影响转染效率；3.实现PAMAM基因递释系统的靶向性。

透明质酸(hyahironicacid，HA)是一种独特的线性大分子酸性粘多糖，作为药物缓释载体具有优良的生物相容性和可降解性。研究发现，某些实体肿瘤和转移淋巴细胞表面存在大量透明质酸受体—CD44，而且CD44目前已成为识别肿瘤干细胞常见的标志物。将HA作为抗肿瘤药物的靶向载体，所形成的粒子或复合物能使更多的药物进入肿瘤组织，增加药物在肿瘤和淋巴结中的吸收和滞留时间，从而提高药物的疗效，降低毒副作用。

发明内容

本发明目的是：针对现有的单一PAMAM基因载体存在的不足，而提供一种基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物，该基因载体复合物制备简单，能更有效的将治疗性基因药物送入肿瘤组织，并提高药物在肿瘤和淋巴结中的吸收和滞留时间，从而提高药物的疗效，同时具有更低的毒副作用。

本发明的技术方案是：一种基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物，其特征在于该基因载体复合物是由HA、PAMAM和gene通过相互静电（吸附）作用自组装组成的复合体系，表示为HA/PAMAM/gene，其中PAMAM选自不同代数的聚酰胺-胺树状大分子，HA选自不同分子量的透明质酸及其钠盐，gene选自治疗性基因药物。

进一步的，本发明中所述基因载体复合物中的PAMAM与治疗性基因药物的正负电荷比为24:1～10:1；PAMAM与HA的正负电荷比为1:0.05～1:1。

优选的，本发明中所述PAMAM是末端带有氨基，以乙二胺为核的3.0、4.0、5.0或6.0代的聚酰胺-胺树状大分子。

优选的，本发明中所述治疗性基因药物是指siRNA和DNA。在实际实施时，其中的siRNA优选为negative control siRNA，该siRNA的

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

优选的，本发明中所述透明质酸及其钠盐的分子量范围为5000Da-200000Da。在实际实施时，优选分子量为11000Da的透明质酸及其钠盐。

本发明的另一目的是提供一种上述基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物的制备方法，包括下述步骤：

（1）将PAMAM的水溶液与gene的水溶液混合孵育，通过静电吸附作用形成PAMAM/gene的复合物；

（2）向步骤（1）得到的PAMAM/gene的复合物中加入HA溶液，室温孵育通过静电吸附作用自组装形成HA/PAMAM/gene三元复合物；

其中PAMAM选自不同代数的聚酰胺-胺树状大分子，HA选自不同分子量的透明质酸及其钠盐，gene选自治疗性基因药物。

进一步的，上述制备方法的步骤（1）中所述PAMAM的水溶液由下述方法配制而成：