[发明专利]一种提高百合多糖活性的酶法修饰制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农产品功能成分制备技术领域，涉及一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。

背景技术

百合是国家卫生部审批通过的首批药食两用品之一，不仅在临床上有着广泛的应用，而且还具有很好的保健作用，百合多糖是百合的主要功能因子之一。研究表明百合多糖具有增强免疫，抗肿瘤等生物活性。通过超声波辅助热水浸提法，我们从百合中提取一种百合多糖，分子量为403.3kDa，主要由甘露糖、葡萄糖按1∶1的摩尔比通过β-1，4糖苷键组成(含有少量1→2或1→6键型)，还含有微量的阿拉伯糖和少量硫酸基团。采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖免疫调节活性，发现该百合多糖活性较低，主要原因可能是其分子量过大，粘度较高所致。因此，通过对百合多糖化合物结构进行改造，降低分子量，寻找活性更强的百合多糖修饰产物的研究具有重要意义。

对于化合物的分子修饰，可采用物理、化学或生物(酶法)。相对于物理或化学方法，采用酶法对百合多糖进行降解具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖。β-葡聚糖酶能专一性作用于β-葡聚糖的β-1，4和β-1，3糖苷键产生低聚糖。但是，我们前期的实验表明两种酶单独作用于百合多糖时效率较低。因为两种酶有着相似的最适作用温度和pH，因此我们将两种酶以一定的用量比复合应用于百合多糖的降解，获得较好的作用效果。

本发明采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖进行可控降解修饰，通过反应条件控制，以期获得系列高活性的百合多糖修饰产物。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于针对百合多糖活性低的问题，提供一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。

技术方案

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰，酶作用条件为：底物百合多糖浓度30～40g/L；β-甘露聚糖酶浓度500～900U/L，β-葡聚糖酶250～450U/L；pH5.5～6.5(PBS缓冲液)；温度40～55℃；时间0.5～1.0h。

反应结束后去除酶及产物分离制备方法为：反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物，百合多糖修饰产物的分子量是8.0kDa～70.0kDa。

采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及修饰产物体外免疫调节活性，修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5～77.2％。

本发明技术与产品具有如下的有益效果：采用酶法对百合多糖进行降解修饰具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点；通过可控降解修饰，修饰产物的免疫活性明显提高，生物修饰后的百合多糖可广泛应用于医药和功能食品领域。

具体实施方式

研究中所用的酶活力及生产公司如下：β-甘露聚糖酶(10000U/g)，禾本生物工程有限公司；β-葡聚糖酶(50000U/g)，上海工硕生物技术有限公司。

实施例1

按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度30/L；β-甘露聚糖酶浓度500U/L，β-葡聚糖酶250U/L；pH5.5(PBS缓冲液)；温度40℃；时间0.5h。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：70.0kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5％。

实施例2