[发明专利]一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法

权利要求书

1.一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:步骤一：土霉素包被原的制备；步骤二：建立测定土霉素的酶联适配体分析方法（ELAA）；步骤三：采用ELAA 对加标样品中土霉素含量的测定。

2.根据权利要求1 所述的一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其特征在于：所述的包被原是采用邻联甲苯胺法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与载体蛋白偶联获得的偶联物，其载体蛋白可以是BSA，也可以是OVA。

3.根据权利要求1 所述的一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其中所述步骤二包括：(1). 以碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶1600，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，PBST缓冲液洗涤液3～5次，拍干;(2). 每孔加入200μL 含0.1%BSA的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，37℃孵育2h，PBST洗涤后烘干备用;(3). 用PBS缓冲液将土霉素标准品稀释成0，0.5，1，2，5，10，50 ng/mL系列浓度，将上述稀释后的标准品及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；以适配体稀释液将生物素标记的适配体稀释成2nmol/L，然后每孔加入50μL，37℃温育1h，然后以PBST 洗涤液洗涤3～5 次，拍干;(4) 将辣根过氧化物酶标记的亲和素（Avidin/HRP）用适配体稀释液以1∶4000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h 后以PBST洗涤液洗涤3～5 次；拍干;（5）每孔加入TMB显色液100μL，37℃显色15min ；（6）加入终止液2mol/L硫酸溶液，每孔100μL ；酶标仪450nm 测吸光值，根据标准品制备的标准曲线对比计算出待测样品的土霉素含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述土霉素适配体的核苷酸序为5’-CGT ACG GAA TTC GCT AGC GGG CGG GGG TGC TGG GGG AAT GGA GTG CTG CGT GCT GCG GGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3’，并且所示序列5’端修饰了生物素。

5.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液（pH 9.6）；步骤（2）中的封闭液为含0.1%BSA的0.05mol/L碳酸盐缓冲液；步骤（3）和（4）中的适配体稀释液含0.1%BSA的PBST溶液；步骤 (6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；步骤（1）～（4）中PBST洗涤液为含0.05% Tween-20的0.01mol/L PBS溶液。

6.根据权利要求1 所述一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法，其中所述步骤三包括：（1）组织样品前处理方法:称取1g组织样品于50mL离心管中，加入4mL提取液，涡旋10min， 15000r/min离心10min；取上清液50uL，加入450μL PBS缓冲液（pH 7.4），涡旋混匀，取100μL用于ELAA分析;（2）牛奶前处理方法:量取牛奶样品5.0mL，加提取液5.0mL，涡旋10min，15000r/min离心10min；弃去脂肪层，吸取清液50μL加入950μL PBS缓冲液，涡旋混匀，取100μL用于ELAA分析;（3）奶粉前处理方法:称取1g奶粉于50mL 离心管中，加入10mL提取液，涡旋10min， 15000r/min离心10min；取上清液50μL，加入450μL PBS缓冲液（pH 7.4），涡旋混匀，取100μL 用于ELAA分析;（4）蜂蜜前处理方法:准确称取0.5g 蜂蜜样本于50mL旋盖离心管中，加入10mL PBS缓冲液（pH 7.4），涡旋2min，超声5min，取上清液100μL 用于ELAA分析。

7.根据权利要求6 所述方法，其中所述的提取液为三氯乙酸溶液（1.25g/L）、Tween-20（0.05%）和甲醇以4:1:1体积比混合，添加0.05%巯基乙醇，使用前用超纯水稀释一倍。