[发明专利]一种间接竞争酶连适配体检测土霉素残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测食品中土霉素残留的酶联适配体分析方法(ELAA)，属于食品安全分析技术领域。

背景技术

土霉素(Oxytetracycline，OTC)，别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药，且由于其广谱抗菌活性和低费用常被用作畜禽的抗菌促生长添加剂。但目前一些养殖者盲目追求利益，不遵守休药期规定，造成畜禽和水产品中土霉素残留严重，经过食物链被人体吸收后，可导致骨骼缺钙和造成肝损害，最明显的残留毒性是诱导耐药菌株。另外，土霉素在畜禽体内60%-90%以药物原形或初级代谢产物的形式随粪尿等排泄物进入环境，给对地表水、农田土壤甚至地下水造成污染，这将导致对人类公共健康产生严重威胁。许多国家对抗生素残留实行监控，世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府规定土霉素的残留限量不得高于100mg/kg。因此，加快对土霉素残留的检测的探究，建立高灵敏、准确、快速的检测方法，对保障我国食品安全和消费者健康具有重要意义。

目前，检测土霉素（Tetracyclines）的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳技术(CE)、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)、薄层色谱法（TCL）流动注射电化学发光法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析分析法(GICA)等。仪器分析方法虽然灵敏度高、结果准确可靠等优点，但设备昂贵、操作复杂，检测时间长，不能满足大批量样品筛选和现场快速检测的需要。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，其中以ELISA和GICA方法应用最多。但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、且繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术的应用。

核酸适配体（Aptamer）技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。Aptamer作为一种新型的识别分子，是采用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，性质稳定；易于标记，可反复使用和长期保存等优点。显然，适配体的这些特点对于发展高灵敏、高选择性、快速高通量的靶标分子检测十分重要，并日渐成为分析化学领域研究和应用的焦点。

目前已有关于酶联适配体检测土霉素相关文献的报道，如刘宾（暨南大学硕士论文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限低（1.5g/L），高于世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对食品中土霉素残留限量的规定（100 mg/L），不能满足对土霉素检测的需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种检测食品中土霉素含量的酶联适配体分析方法，其特点是以适配体代替传统抗体，基于抗原和适配体特异性结合而建立的分析方法。该方法不需要制备抗体，操作简便，灵敏度高，特异性强，能够批量、快速检测食品中土霉素的残留。

本发明所提供的食品中土霉素残留酶联适配体（ELAA）检测方法，通过以下步骤实现。

1．BSA-土霉素包被原的制备：采用文献（Zhang Y, Lu S, Liu W, et al. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 211-218）报道的邻联甲苯胺法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到包被原。将BSA或OVA、OTC和偶联产物，于波长190～600nm 下进行扫描鉴定。

2．间接竞争性ELAA方法。

（1）包被抗原：每孔加100μL 1600× 稀释的包被抗原OTC-BSA，4℃孵育过夜，PBST缓冲液洗涤液3～5次，拍干。

（2）封 闭：每孔加入200μL 的封闭液，37℃孵育2h，PBST洗涤后烘干备用。

（3）加 样：每孔依次加入50μL待测样品或稀释好的标品溶液，然后加入50μL 2nmol/L的适配体，37℃孵育1h，后洗涤液洗涤3～5次，拍干。