[发明专利]hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库在审

专利信息
申请号: 201310407540.7 申请日: 2013-09-01
公开(公告)号: CN104419674A 公开(公告)日: 2015-03-18
发明(设计)人: 翁炳焕;徐向荣;李晓;孙义锡;罗玉琴;金帆 申请(专利权)人: 翁炳焕
主分类号: C12N5/10 分类号: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 317300 浙江省*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: htert 诱导 构建 先天性 心脏 病房 间隔 缺损 细胞 模型 及其
【权利要求书】:

1.一种用于医学领域的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo,以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物,构建pLXSNneo-hTERT重组子,转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并抽提质粒,以脂质体转染离体传代呈对数生长的先天性心脏病房间隔缺损细胞,使重组子与细胞DNA整合,并扩大培养经G418筛选含阳性重组子克隆,筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导先天性心脏病房间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮,为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。

2.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是所指细胞模型为(1)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长;(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴,细胞数量为纵轴,在hepato ZYME—SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成;(3)细胞染色体核型为二倍体“46,XX”或“46,XY”,或相同于本发明采集的原代细胞;(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆);(5)细胞为非恶化细胞,裸鼠致瘤试验阴性;(6)细胞的DNA中整合了hTERT基因,表达hTERT基因的mRNA产物;(7)细胞传代至第95代、培养至第9天时,呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底,其细胞生长汇合率达82%以上,此后随着传代次数的增加,细胞生长变慢、变稀疏;(8)用于集中保存hTERT转染的可再生的先天性心脏病房间隔缺损细胞的遗传资源并用于在体外从细胞水平研究环境因素致先天性心脏病房间隔缺损的发病机制、研究对环境有害物的耐受性。

3.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的先天性心脏病房间隔缺损患儿羊水脱落细胞构建之。

4.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是所用的培养液为含有20%胎牛血清、5~10nmol/L胰岛素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5~10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的先天性心脏病房间隔缺损组织细胞,在原代扩增培养中,其收集指标是细胞贴壁培养约3~4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10%、贴壁细胞的汇合率达75%~85%、处于刚进入对数生长期时收集细胞;用作脂质体转染法导入重组子的传代先天性心脏病房间隔缺损组织细胞,其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10%小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55%~65%、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞;传代细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80~85%、处于对数生长期的前期时收集细胞;染色体核型分析的细胞收集指标是细胞生长密度达85-95%、小园形细胞占10%以上、处于对数生长期的细胞。

6.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是以0.01%胶原酶II消化贴壁生长的先天性心脏病房间隔缺损组织细胞,作染色体核型分析时,每5mL培养液中加入250ug/ml秋水仙素100ul,混匀后置37℃培养箱4小时。

7.根据权利要求1所述的hTERT诱导构建先天性心脏病房间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法,其特征是细胞库的构建包括(1)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的hTERT诱导的先天性心脏病房间隔缺损细胞;(2)作传代、扩大培养,取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞;(3)经消化、终止、离心(1200r/min,6min)步骤收获细胞;(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5×105个/ml的细胞悬液;(5)按照4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,过夜;入-196℃液氮的程序冻存细胞;(6)可再生性地长期保存hTERT诱导先天性心脏病房间隔缺损细胞模型,备作遗传资源和科研材料。

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