[发明专利]一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丁酮，又名乙偶姻（acetoin）、乙酰甲基甲醇，通常为淡黄色液体或晶体，天然存在于玉米、葡萄、草莓、干酪、肉类等食品中，是一种应用广泛的香料，我国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，美国食品和萃取协会（FEMA）安全号为2008。此外，3-羟基丁酮还可以作为化学合成中的重要原料，比如可用于合成手性近晶材料和向列材料。

3-羟基丁酮的传统化工制备主要是采用化学法或者酶法转化，其原料主要是双乙酰（丁二酮）和2,3-丁二醇。但是这些方法的原料昂贵，而且往往条件苛刻，设备要求高。另外，还可以采用微生物发酵法生产3-羟基丁酮。在微生物中，两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase,ALS）作用下合成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸经乙酰乳酸脱羧酶(acetolactate decarboxylase,ALDC)作用即可生成3-羟基丁酮。在一些微生物中，3-羟基丁酮还可以被进一步还原生成2,3-丁二醇。目前人们已经发现很多可以产生3-羟基丁酮的菌种，例如：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等奶制品或者酿酒发酵菌株，可以产生少量的3-羟基丁酮（通常低于1g/L）。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、产气节杆菌（Enterobacter aerogenes）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等主要用来生产2,3-丁二醇的菌种也能够产生3-羟基丁酮。

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是目前生产丁醇的主要菌种。其发酵产物除丁醇外，还有丙酮和乙醇，因此在生产中又被称为ABE（Acetone-Butanol-Ethanol）发酵。通常，60g/L的葡萄糖经丙酮丁醇梭菌发酵可产生12g/L的丁醇，6g/L的丙酮以及2g/L的乙醇，丁醇:丙酮:乙醇的比值为6:3:1（w/w）。除ABE外，丙酮丁醇梭菌还会产生少量的3-羟基丁酮。在丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC824中，3-羟基丁酮的产量通常情况下不足1g/L（Collas,F.,Kuit,W.,Clément,B.,Marchal,R.,López-Contreras,A.M.,Monot,F.,2012.Simultaneous production of isopropanol,butanol,ethanol and 2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC824engineered strains.AMB Express2,45；Roos,J.W.,McLaughlin,J.K.,Papoutsakis,E.T.,1985.The effect of pH on nitrogen supply,cell lysis,and solvent production in fermentations of Clostridium acetobutylicum.Biotechnol.Bioeng.27,681-694）。在控制搅拌速度和压力的条件下，3-羟基丁酮最高产量达到2.2g/L（Doremus,M.G.,Linden,J.C.,Moreira,A.R.,1984.Agitation and pressure effects on acetone-butanol fermentation.Biotechnol.Bioeng.27,852-860）。Kanouni等人将丙酮丁醇梭菌ATCC824经3-氟丙酮酸诱变后，筛选得到最高3-羟基丁酮产量达3.5g/L的突变株（A.EI Kanouni,A.M.Junelles,R.Janati-Idrissi,H.Petitdemange,R.Gay,1989.Clostridium acetobutylicum Mutants Isolated for Resistance to the Pyruvate Halogen Analogs.CURRENT MICROBIOLOGY18,139-144），据我们所知，这是丙酮丁醇梭菌中目前文献报道的最高乙偶姻产量。

提高丙酮丁醇梭菌的3-羟基丁酮产量有以下几方面的意义: