[发明专利]一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用。

背景技术

免疫增强剂是指能够促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质。因其具有安全、广谱、高效、无毒、无污染、低成本等诸多优点，目前已在畜牧养殖中作为饲料添加剂广泛应用。但快速发展的水产养殖业所需的免疫增强剂的开发和应用仍处于起步阶段，其中较为关键的就是解决活性物质的导入技术和应用方法的难题。

表面展示（Surface display）技术是一种较新的基因工程技术，它使表达的外源肽或蛋白质以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞的表面，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，借以研究多肽（蛋白质）的性质、相互识别和作用等。目前利用酵母菌进行表面展示的技术已发展相对成熟，其中利用酒精酵母表面展示的系统已经完全商品化。

TNF是机体免疫调控的关键组分，其功能活性包括诱发细胞凋亡、介导细胞毒反应、提高吞噬细胞吞噬活性、诱导相关细胞因子和免疫效应物质的表达等多种功能，在机体的正常或病理条件下均发挥着重要的调控作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF，重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示。

进一步的说，通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子（RpTNF）展示于解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）上，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株。

所述表面展示过程为：

1）以菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子（RpTNF）编码区为模板，采用P1和P2为引物进行PCR扩增，待用；

2）PCR扩增产物与pMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与经HindIII，BamHI双酶切后表面展示载体连接；

3）将上述构建连接载体转入解脂耶罗维亚菌株中进行诱导培养，经免疫荧光检测，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株；

所述引物分别P1(5’-CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3’)和P2（5’-CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3’）。

所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为抗弧菌感染的免疫增强剂。

所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为提高菲律宾蛤仔存活率的免疫增强剂。

本发明所具有的优点：

本发明利用表面展示（Surface display）技术获得重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子（RpTNF），经表面展示的重组RpTNF酵母菌可直接应用，不需要经过提纯，应用方式简单，且具有激活机体免疫，增加抗细菌感染能力，提高宿主的存活率等多重效果。

本发明是通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子（RpTNF）展示于安全的微生物解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）上。操作简单，改造后的酵母可直接应用菲律宾蛤仔的水产养殖，可增强养殖动物抗弧菌感染能力，明显提高其存活率。因而实施将其应用在水产养殖领域中。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同剂量RpTNF酵母提高菲律宾蛤仔弧菌感染后存活率的情况图。

具体实施方式

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实验例1

菲律宾蛤仔RpTNF酵母表面展示氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示。

SEQ ID NO.1

MKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADMVPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFI

YSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINKPIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSY

VSSLAELKAGDELSVKVSNITYIRYTRDNYFGVNLI

序列特征：