[发明专利]采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及13份花椰菜杂交种品种鉴定方法，是一种基于EST-SSR标记的高效、简便进行花椰菜品种鉴定的方法。

背景技术

花椰菜属于甘蓝的变种，为十字花科植物，是一种很受人们欢迎的蔬菜，味道鲜美，营养丰富，同时具有很高的药用价值，目前我国南北各地均有种植。中国市场花椰菜品种为常规种与杂交种并存状态，同名异物及同物异名现象比较普遍，而花椰菜品种田间形态学上的鉴别易受环境和人为因素的影响，再加上生长期长，因此进行花椰菜优良性状早期鉴定和遗传关系研究十分必要。

随着分子生物学技术的发展，遗传多样性不仅是表现在表型性状上的差异，更重要的是表现在DNA水平上的差异。分子标记的发展为从DNA水平上检测品种及品系间的遗传多样性提供了有利的工具。EST(Expressed sequence tags)即表达序列标签，是指通过对cDNA文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150～500bp。EST计划由美国科学家Venter于1989年首次提出，并首先应用于人类基因组的研究，之后被广泛用于植物基因组的研究。随着EST计划在不同物种间的不断扩展和深入研究，数据库中已积累了大量的EST，为SSR标记的开发带来了新的契机，已成为SSR标记的重要来源。为了区别于传统的gSSR，一般将来源于EST库的SSR标记称为EST-SSR标记，该标记的显著特点是来自基因组的转录区域，同时信息量较高，开发过程既简单又快捷，费用低、通用性好，而且效率也高。因此，EST-SSR作为共显性标记与其他分子标记相比具有诸多优点。

目前EST-SSR标记已经应用于水稻(Cho et al.，2000)、葡萄(Scott et al.，2000)、小麦(Gupta et al.，2003；Gao et al.，2004；Nicot et al.，2004)、黑麦(Hackauf et al.，2002)、大麦(Thiel et al.，2003)和扁桃(Xu et al.，2004)、玉米(Wang and Bowen，1998)、甘蔗(Cordeiro et al.，2001)等植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于花椰菜品种鉴定的EST-SSR引物，其特征在于，包括5对EST-SSR引物：

HYC33上游引物序列：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3’，HYC33下游引物序列：5’-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3’；BC5上游引物序列：5’-CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC-3’，BC5下游引物序列：5’-CCTTGCTTGCATCAGTTTCA-3’；HYC10上游引物序列：5’-CATGAAAGGCGAAGAGAAGC-3’，HYC10下游引物序列：5'-ACACACCCAAGGCTTGTAGG-3’；BC20上游引物序列：5'-CCACCATCGCTTCTCAGATT-3’，BC20下游引物序列：5’-GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG-3’；BC28上游引物序列：5'-TAACTTCTCCCCCGTCCTCT-3’，BC28下游引物序列：5’-GAGATGGCTACAGTGGCTCC-3’。

本发明进一步公开了采用EST-SSR标记进行花椰菜品种鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的EST-SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10μL，扩增反应体系为：2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度100ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；PCR反应程序为95℃预变性2min，32个扩增循环(94℃40sec，56℃45sec，72℃1min)；72℃延伸7min，4℃保存；

(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，凝胶组分为：去离子水21mL，10×TBE3mL，40％PAG6mL，TEMED30μL，10％过流酰胺300μL；设定电压250V，电泳1h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；