[发明专利]一种人源annexin A2的生产方法及其应用

权利要求书

1.一种人源annexin A2的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)用Trizol RNA提取试剂盒提取人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的总RNA，提取的总RNA用无RNAase的DEPC水溶解；将提取的细胞总RNA，用下游引物5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’进行反转录，反转录获得的cDNA进行PCR扩增；

2)将核苷酸序列插入原核表达载体pET-21b(+)中，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌E.coli.BL21(DE3)中，做质粒转化处理，并抽提质粒；

3)质粒转化到宿主细菌E.coli.DH5α中，含AMP50μg/mL的LB培养基于37℃下培养3h后，筛选阳性克隆添加终浓度为0.75-1.25mmol/L的IPTG于25-37℃下诱导3-6h，得到annexin A2。

2.根据权利要求1所述的人源annexin A2的生产方法，其特征在于：步骤1）中，提取的细胞总RNA，用下游引物5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’进行反转录，反转录体系：下游引物1μL，AMV反转录酶0.5μL，5倍Buffer2μL，DNTP1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA与水合计5μL，反应条件：42℃，45min；92℃，5min；冰水浴5min；反转录获得的cDNA进行PCR扩增，扩增反应体系：2倍Taq plus10μL，模板cDNA5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水3μL，反应条件：94℃预变性3min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min，PCR扩增引物：5’-AATGGGTCGGGATCCGTCTA G-3’，5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’。

3.根据权利要求1所述的人源annexin A2的生产方法，其特征在于：步骤3）中，IPTG的终浓度为1mmol/L。

4.根据权利要求1所述的人源annexin A2蛋白的生产方法，其特征在于：步骤3）中，添加IPTG于37℃下诱导。

5.根据权利要求1-3所述的任一人源annexin A2蛋白的生产方法，其特征在于：步骤3）中，IPTG诱导6h。

6.根据权利要求1所述的人源annexin A2蛋白的生产方法，其特征在于：步骤3）中，添加终浓度为1mmol/L的IPTG于37℃下诱导6h，得到人源annexin A2。

7.根据权利要求1或6所述的人源annexin A2的生产方法，其特征在于：还包括纯化步骤4）使用浓度为100-1000mmol/l的咪唑梯度洗脱进行纯化，用镍亲和柱纯化获得人源annexin A2蛋白。

8.根据权利要求7所述的人源annexin A2蛋白的生产方法，其特征在于：所述咪唑浓度为800mmol/l。

9.如权利要求1或6所述的人源annexin A2蛋白在制备人annexin A2蛋白生物制剂中的应用。

10.如权利要求8所述的人源annexin A2蛋白在制备人annexin A2蛋白生物制剂中的应用。