[发明专利]一种人源annexin A2的生产方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是指一种人源annexin A2（膜联蛋白A2)的生产纯化方法及其应用，具体阐述为膜联蛋白A2（annexin A2）cDNA的获得与扩增，表达annexin A2的菌种的筛选扩建，以及annexin A2蛋白的纯化、保存，最终以生物制剂的形式服务于医疗领域。

背景技术

Annexin A2，又名P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-IV。其基因位于15q21-q22，蛋白分子量为36kD，在人体内皮细胞、单核／巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中表达丰富。研究表明，annexin A2蛋白具有Ca²⁺依赖性结合磷脂、细胞骨架蛋白的重要特性，从而将其归入annexins蛋白超家族的Ａ亚家族中。尽管已发现annexins家族成员多在细胞生长和信号转导的调节方面发挥作用，但annexin A2蛋白的具体生物学功能还不清楚。实验证明，annexin A2与人类许多疾病的发生发展显著相关，尤其是其在心血管、肿瘤性疾病中的作用机制成为当前的研究热点。在我们的前期研究中，我们发现内皮细胞表面的annexin A2可作为纤溶酶原与组织型纤溶酶原激活物（t-PA）的共受体，发挥着调节纤溶酶活性的作用。内皮细胞磷脂膜上的annexin A2存在着Lys-PLG（PLG前体）和t-PA的结合位点，脂蛋白a和同型半胱氨酸能分别竞争性地拮抗Lys-PLG和t-PA与annexin A2的结合。在annexin A2基因敲除小鼠上发现，内皮细胞表面t-PA依赖的纤溶酶水平明显下降，以至不能完全清除损伤后所形成的动脉血栓。纯化的annexin A2可增加纤溶酶原的激活效率约60倍。为了进一步研究annexin A2蛋白在其他疾病中的作用，获得该蛋白的成为当前的首要任务。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种人源annexin A2的生产方法。

一种人源annexin A2的生产方法，包括如下步骤：

1)用Trizol RNA提取试剂盒提取人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的总RNA，提取的RNA用无RNAase的DEPC水溶解；将提取的细胞总RNA，用下游引物5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’进行反转录，反转录获得的cDNA进行PCR扩增；

2)将核苷酸序列插入原核表达载体pET-21b(+)中，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌E.coli.BL21(DE3)中，做质粒转化处理，并抽提质粒；

3)质粒转化到宿主细菌E.coli.DH5α中，含AMP50μg/mL的LB培养基于37℃下培养3h后，筛选阳性克隆添加终浓度为0.75-1.25mmol/L的IPTG于25-37℃下诱导3-6h，得到annexin A2。

进一步的，步骤1）中，提取的细胞总RNA，用下游引物5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’进行反转录，反转录体系：下游引物1μL，AMV反转录酶0.5μL，5倍Buffer2μL，DNTP1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA与水合计5μL，反应条件：42℃，45min；92℃，5min；冰水浴5min；反转录获得的cDNA进行PCR扩增，扩增反应体系：2倍Taq plus10μL，模板cDNA5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水3μL，反应条件：94℃预变性3min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min，PCR扩增引物：5’-AATGGGTCGGGATCCGTCTA G-3’，5’-CAGGACCTTATCTCGCGTCC-3’。

进一步的，步骤3）中，IPTG的终浓度为1mmol/L。

进一步的，步骤3）中，添加IPTG于37℃下诱导。

进一步的，步骤3）中，IPTG诱导6h。

进一步的，步骤3）中，添加终浓度为1mmol/L的IPTG于37℃下诱导6h，得到人源annexin A2。

进一步的，还包括纯化步骤4）使用浓度为100-1000mmol/l的咪唑梯度洗脱进行纯化，用镍亲和柱纯化获得人源annexin A2蛋白。

更进一步的，所述咪唑浓度为800mmol/l。

本发明还描述了膜联蛋白A2在制备人annexin A2蛋白生物制剂中的应用。

下面对本发明作进一步的说明：

膜联蛋白A2的生产方法，包括如下具体步骤：