[发明专利]聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒

权利要求书

1.聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒，其特征在于包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2：235delC、299delAT引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人基因组DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；所述一系列标准品包括：235delC分型标准品、299delAT分型标准品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

用于GJB2：235delC、299delAT检测的引物为：

SEQ NO.1：5’-ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’；

SEQ NO.2：5’-CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’；

用于GJB2：299delAT突变检测的探针为：

SEQ NO.5：5’-CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTCC-3’；

用于GJB2：235delC突变检测的探针为：

SEQ NO.6：5’-ACATCCGGCTATGGGCCTC-3’

用于对人基因组DNA进行检测的通用探针为：

SEQ NO.7：5’-ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3’；

其中LNA核苷以黑体字表示。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的内对照为一段人工合成的序列装载到pMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ NO.4)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为：

SEQ NO.8：CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC

SEQ NO.9：5’-CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’

SEQ NO.1O：5’-GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’

SEQ NO.11：5’-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的用于GJB2：235delC、299delAT突变检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针，内对照探针，每条探针的5’端和3’端均进行荧光染料标记，5’端为发光基团和3’端为淬灭基团。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于对GJB2：235delC、299delAT突变进行特异性检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针被分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。

6.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于：探针所分为的四组为：用于对GJB2：299delAT突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对235delC突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人基因组DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团。

7.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于：5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为：ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA、ROX、/Texas Red、Cy5；3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为：BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。

8.根据权利1要求所述的试剂盒，其特征在于：包括一系列标准品：235delC分型标准品(10ng/uL的235delC杂合型突变DNA标本1管)、299delAT分型标准品(10ng/uL的299delAT杂合型突变DNA标本1管)。

9.权利要求1所述试剂盒应用于聋病易感基因的检测，其特征在于通过荧光定量PCR特异性检测聋病易感基因GJB2：235delC、299delAT；用于299delAT检测的引物探针为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.5；用于GJB2：235delC突变检测的引物探针为：SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.6；用于对人基因组DNA检测的引物探针为：SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.7；用于对内对照检测的引物探针为：SEQ NO.9、SEQ NO.10、SEQ NO.11。所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时检测，通过与标准品的同步扩增和分析，得出所测标本的分型信息或突变比例信息。