[发明专利]聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及聋病易感基因GJB2235delC、299delAT突变检测试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。

在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50％。目前，在该基因已经发现了100多种突变类型，在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14％，约22.2％的中国耳聋患者与该突变有关。另外GJB2299_300delAT的突变等位基因频率约为3％。

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。对于染色体突变的基因分型，一般的荧光定量试剂盒往往需要对同一个标本进行多管检测，才能获得2个以上的分型信息。

本发明以上述2个聋病易感基因位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增和荧光定量检测，与基因分型标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定基因型。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；首次利用四通道/四色染料-荧光定量PCR检测的方法实现了2位点分型检测的目标，并含有内对照以监控检测过程。闭管检测防止了开盖检测操作而产生的污染，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。

发明内容

本发明目的是提供一种可在1个小时内同时检测聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变，区分基因型并含有内对照以监控检测过程。

为了实现上述目的，采取的技术方案：一种聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品；

所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2：235delC、299delAT的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人基因组DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；

所述一系列标准品包括：235delC分型标准品(10ng/uL的235delC杂合型突变DNA标本1管)、299delAT分型标准品(10ng/uL的299delAT杂合型突变DNA标本1管)。

所述用于对GJB2：235delC、299delAT突变进行特异性检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针，对内对照进行检测的探针被分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。

所述探针所分为的四组为：用于对GJB2：299delAT突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对235delC突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人基因组DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团。

所述5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为：ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA、ROX、/TexasRed、Cy5；3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为：BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。