[发明专利]聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒

权利要求书

1.聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，其特征在于包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增线粒体12SrDNA：1494C>T、1555A>G的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人线粒体DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；所述一系列标准品包括：1494C>T突变比例标准品、1555A>G突变比例标准品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

用于线粒体12SrDNA：1494C>T、1555A>G检测，人线粒体DNA序列检测的引物为：

SEQ NO.1：5’-GTAAGTTGGGTGCTTTGTGTTAAG-3’

SEQ NO.2：5’-GCCCTGAAGCGCGTACA-3’；

用于线粒体12SrDNA1555A>G突变检测的探针为：

SEQ NO.3：5’-AGTACACTTACCATGTTACGACTTGCCTCCTC-3’

用于线粒体12SrDNA1494C>T突变检测的探针为：

SEQ NO.4：5’-GTGAAGTATACTTGAGGAGaGTGACGGGAC-3’；

用于对人线粒体DNA进行检测的通用探针为：

SEQ NO.5：5’-TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCT-3’

其中LNA核苷以黑体字表示。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的内对照为一段人工合成的序列装载到pMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ NO.6)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为：

SEQ NO.6：CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC

SEQ NO.7：5’-CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’

SEQ NO.8：5’-GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’

SEQ NO.9：5’-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的用于线粒体12SrDNA：1494C>T、1555A>G突变检测的探针，对人线粒体DNA进行检测的通用探针，内对照探针，每条探针的5’端和3’端均进行荧光染料标记，5’端为发光基团和3’端为淬灭基团。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于对线粒体12SrDNA：1494C>T、1555A>G突变进行特异性检测的探针，对人线粒体DNA进行检测的通用探针，内对照探针分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。

6.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于：探针所分为的四组为：用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；线粒体12SrDNA：1494C>T突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；1555A>G突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人线粒体DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团。

7.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于：5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为：ALEXA Fluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA、ROX、/Texas Red、Cy5；3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为：BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。