[发明专利]聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，属于生物检测技术领域。 

背景技术

世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80％患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。 

药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A>G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10％的具有12S rRNA基因1555A>G突变，美国语前听力损失患者中，1555A>G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A>G突变与15-20％的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊发现的耳聋患者中，约5％的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达12％的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了12S rRNA基因1494C>T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C>T突变导致的。1555A>G突变和1494C>T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。由于线粒体的异质性特征，不同的个体表现出的线粒体突变的比例不同。大量研究表明，1555A>G和1494C>T突变线粒体所占有的比例高低与病情存在一定的相关性，通常突变线粒体所占比例高的个体表现出重度耳聋，而占比低的则表现出轻度耳聋或正常。但是即使突变占比很低，仍存在药物致聋的危险。因此，一方面需要能够分辨出突变比例的试剂盒来为线粒体聋病相关突变提供更方便的研究手段，另一方面要求这些试剂能够对低突变比例标本有很好的检出能力。 

目前常用的基因检测方法有：直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。对于染色体突变的基因分型，一般的荧光定量试剂盒往往需要对同一个标本进行多管检测，才能获得2个以上的分型信息。对于线粒体DNA的突变比例检测，质谱法能检出5％左右的突变，而测序和基因芯片对于突变线粒体的选择能力只能达到20％左右，难以分辨出更低突变比例的标本。 

本发明以上述线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的 扩增和荧光定量检测，与突变比例标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定各种突变的比例。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；首次利用荧光定量PCR检测的方法实现了1494C>T、1555A>G的突变比例检测的目标，大大节约了人力物力和时间。高灵敏度高特异性同时检测，提供染色体相关突变的分型信息，对于线粒体1555A>G和1494C>T突变的选择能力达到了0.1％。闭管检测防止了开盖检测操作而产生的污染，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。 

发明内容

本发明目的是提供一种可在1个小时内同时检测聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变，同时报告各种突变的比例的荧光检测试剂盒。