[发明专利]香菇C91-3菌株的Latcripin-4基因片段、编码蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-4基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有RCC1和ANK结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。 

背景技术

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321-327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。 

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-4基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有RCC1和ANK结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。 

本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Latcripin-4基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。 

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-4基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。 

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-4基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行： 

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c.  PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ 和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物BamHⅠ：

5'-GGCTGATATCGGATCCACCTCACTTCATGCACACT-3' 

下游引物XhoⅠ：

5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCAAACATGCCATCGCACTT-3' 

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化1386bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4?C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4?C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。