[发明专利]一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建

说明书

技术领域

本发明涉及大肠-枯草穿梭诱导载体的构建和转化及表达。 

背景技术

近些年来，枯草芽孢杆菌基因组的成功测序催化了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白分泌载体的研究，成绩斐然。基于全基因组的测定，使得通过信号肽预测软件经生物信息学分析识别信号肽并确认分泌蛋白成为可能。结合信号肽预测结果以及已知的分泌蛋白基因结构，将有可能构建一个新的分泌蛋白组(Secretome)，其中包含各种已知的及未知的分泌蛋白信息。通过此种方法，预测得到的枯草芽孢杆菌蛋白质组中已含有4107种蛋白，即占总蛋白25%的蛋白序列含有膜定位信号。 

枯草芽孢杆菌表达系统的优点是：（1）能将蛋白表达产物高效分泌培养基中，在多数情况下，经芽孢杆菌分泌后真核生物的异源重组蛋白就是经过简单折叠的天然构并且具备原有的生物活性；（2）许多芽孢杆菌在传统发酵工业中已经有几十年的历史，它们无致病性而且不产生内毒素；（3）芽孢杆菌的分子遗传背景清楚，生长迅速，培养条件简单。但是由于膜定位能力的缺乏、转移前折叠、转移折叠缓慢、低效转移以及错误折叠和蛋白酶水解等因素，外源蛋白的表达进展受限。 

外源蛋白的高效表达对于真核蛋白对枯草杆菌表达系统来说并不理想，主要的影响因素是外源蛋白与枯草杆菌的分泌元件不协调。为了达到高表达水平和更广的表达范围的目的，须对其分泌机制进行完整且深入的研究，并通过基因工程等手段加以解决。这方面已有成功的报告，如吴青等构建的枯草杆菌诱导型高效-表达分泌系统，在原有诱导系统上添加正调控基因degU及degQ，获得了296倍表达的调控基因sacB，并使地衣杆菌α-淀粉酶的表达量达到原有的140倍。 

枯草芽孢杆菌所承载的质粒的结构和分离上的不稳定性直接影响该表达系统在工业生产中的应用，在大规模生产中，质粒容易发生丢失或结构改变的情况，对目的蛋白的产率造成影响。为了解决这一问题，目前的研究方向集中于：①添加多个正调控基因并使用诱导系统调控外源蛋白的表达；②采取整合表达的方式，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体，以保证质粒的稳定性。 

发明内容

本发明目的在于构建一种使用无毒物质进行诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，通过该载体进行蛋白的表达。 

1、穿梭质粒的构建 

根据上述目的及载体的克隆位点，利用引物设计软件Primer Premier5设计引物，扩增调控序列SacR、标签蛋白GST序列以及目的蛋白序列，连接为重组序列后连入pHY300-PLK空载体，构建重组质粒，重组质粒转化入枯草芽孢杆菌WB600后提取质粒进行双酶切鉴定并对载体进行测序验证。 

2、目的蛋白的表达 

使用枯草芽孢杆菌WB600进行蛋白表达检测，得到融合蛋白。通过SDS-PAGE进行初步验证并获得最优表达时间，对表达产物进行目的蛋白的抑菌效果和GST标签蛋白的Western-Blot验证，证实该载体能够正确表达融合蛋白。 

本发明采用的技术方案是：一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，方法如下： 

1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和NdeI酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列； 

所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC； 

所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG； 

2）制备GST标签蛋白序列； 

3）获得目的蛋白序列； 

4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经该酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒pHY300-PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切后连接，得到重组质粒； 

5）重组质粒的转化：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；