[发明专利]鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。具体而言，本发明涉及利用革兰氏阴性菌特异性表达氨基肽酶在平板上鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。

背景技术

通过革兰氏染色法，将细菌分为两大类，即革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，是对细菌进行鉴别、分类和鉴定的基础，因此，如何准确、便捷区分对于细菌鉴定与分类具有重要意义。

目前对于细菌的革兰氏阴性和阳性区分以染色方法为主，先用龙胆紫（亦称结晶紫）将细菌染成紫色，再涂以革兰氏碘液加强染料与菌体的结合，然后用95％的酒精脱色20～30秒钟，有些细菌不被脱色，仍保留紫色，有些细菌被脱色变成无色，最后再用复红或沙黄复染1分钟，结果已被脱色的细菌被染成红色，未脱色的细菌仍然保持紫色，不再着色，结果凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌(G^﹢菌)；染成红色的称为革兰氏阴性菌（G^ˉ菌），其原理为：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色，为了保证实验结果的准确性，还需要设置对照菌株，该方法自1884年由丹麦医师Gram创立以来一直沿用至今，成为经典方法，但是这样的常规方法使得操作过程繁琐，虽然近年来已基于上述方法开发出细菌革兰氏鉴定染色仪和基于流式细胞技术通过添加特制染料实现细菌革兰氏鉴别，但这些方法需要专用设备的投入和特制试剂，不能满足所有微生物实验室的需求，而且鉴定前需要先分离出纯菌落，并不能节省人力和时间。

1973年Teuber和Cerny(Arch.Mikrobiol.91,235-240,1973)首次描述了大肠埃希氏菌具有特异的氨基肽酶活性，认为可能所有革兰氏阴性菌都具有该种特异性酶，C.Lazdunski（1975,Eur.J.Biochem.65,517-520）用L-丙氨酸-4-硝基苯胺（L-alanine-4-nitroanilide）作为酶底物，利用酶反应方法测试了从大肠埃希氏菌分离出的氨基肽酶活性，Murgier等人(1976,Eur.J.Biochem.65,517-520)用同样方法测试了其他革兰氏阴性菌并证实了上述观点。1978年，G.Cerny用浸染了L-丙氨酸-4-硝基苯胺的滤纸铺设在菌落上面进行孵育（5min），革兰氏阴性菌具有的特异性氨基肽酶分解L-丙氨酸-4-硝基苯胺，释放出对硝基苯胺使菌落产生黄色从而得到识别，从而建立了通过氨基肽酶测试来区分革兰氏阴性、阳性细菌的方法(European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.5,113-122,1978)，但是，该方法所用酶底物由于分解后游离出的发色基团硝基苯胺具有极好的水溶性而迅速扩散，信号减弱，使得该方法不能将底物直接添加到培养基中应用，因此也就无法在菌落生长过程中直接用于革兰氏阴性和阳性细菌的区分，随后出现的同类酶底物L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐（L-Alanine-AMC-TFA），由于释放出的基团4-甲基香豆素为荧光基团，与4-硝基苯胺相比显著提高了检测灵敏度，替代L-丙氨酸-4-硝基苯胺用于人类医学临床样本中L-丙氨酸氨基肽酶的测定，但由于仍未解决扩散问题，未见用于直接添加至平板中用于区分革兰氏阴性和阳性菌。专利WO-A-98/04735和WO-A-99/38995描述了一种不会扩散的用于检测氨基肽酶活性的显色底物；中国专利200480003095.7描述了一种结构较为复杂的显色酶底物；专利EP-B-0.270.946提出了基于吖啶酮的显色底物，然而，这些底物一方面要么难于获得（很难合成，纯度和产量低，不能商品化），要么存在潜在的危害，另一方面，为了使菌落获得明显颜色变化需要精确调整培养基配方，使得目前市场上没有商品化的产品出现。

综上所述，传统革兰氏染色方法操作繁琐，基于传统方法原理的仪器测定需要设备投入，专用耗材成本较高；通过测定氨基肽酶区分细菌革兰氏阴性/阳性菌的方法虽然特异性强，操作简便，但没有解决扩散问题，不能通过平板培养法进行区分革兰氏阴性/阳性菌，成为该项技术不能在本领域进入实质性应用的技术瓶颈。