[发明专利]一种融合型抗菌肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种融合型抗菌肽，其特征在于：是由GST标签蛋白经肠激酶酶切位点连接抗菌肽AWRK6构成的融合型抗菌肽GA。

2.如权利要求1所述的融合型抗菌肽，其特征在于：所述的抗菌肽AWRK6的序列如SEQ ID NO.2所示，其分子量为2130.5，等电点为9.60。

3.一种权利要求1所述的融合型抗菌肽的制备方法，其特征在于方法如下：

1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；

所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；

所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；

2）制备GST标签蛋白序列；

3）按照SEQ ID NO.2所示的序列，设计6条引物pA1-pA6进行PCR pA1-pA6，获得AWRK6序列；

所述的引物pA1的序列是：TATTACCATTAATATGACGACGACGACAAGA；

所述的引物pA2的序列是：GCTTGCCCACCCAGCTCTTGTCGTCGTCGT；

所述的引物pA3的序列是：GCTGGGTGGGCAAGCATGGCAAGAAGTTTG；

所述的引物pA4的序列是：TATGTTTCTTCAGGCCAAACTTCTTGCCAT；

所述的引物pA5的序列是：GCCTGAAGAAACATAAGAAACATTGACTGA；

所述的引物pA6的序列是：TGCCCAAGCTTTCTTTGTATTCTTTGTAAC；

4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick Cut Vsp I酶酶切的抗菌肽AWRK6序列片段进行连接，得到重组序列SGA；将重组序列SGA和提取质粒pHY300-PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I 双酶切后连接，得到重组质粒pHYSGA；

5）重组质粒的转化：将重组质粒pHYSGA转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；

6）选取5）步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡3h，12000rpm离心10min后取上清液，上清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，从培养第8小时开始诱导至第48小时，12000rpm离心10min，取上清，得融合型抗菌肽GA。

4.权利要求1或2所述的融合型抗菌肽作为饲料添加剂的应用。