[发明专利]一种融合型抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合型抗菌肽GA，该肽由GST标签蛋白经肠激酶酶切位点连接抗菌肽AWRK6构成，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定抑菌活性，作为添加剂加入饲料中饲喂鸡雏后证实该融合肽可以提高鸡雏的免疫指标，是禽畜、水产饲料中抗生素的优秀替代品。

背景技术

目前，对于禽畜和水产养殖专业户，为了提高禽畜及水产品的免疫性，大都在饲料中添加抗生素，抗生素的添加不仅产生耐药性，而且存在毒副作用，且污染环境。

抗菌肽（antibacterial peptides，ABP）又称宿主防御肽(host defense peptides，HDPs)或抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是生物体在条件性诱导下产生的具有免疫调节活性和广谱抗菌活性的一种小分子多肽，属非特异性防御系统的重要组件，几乎存在于所有生命形式如植物、昆虫、两栖动物、鱼类、鸟类、哺乳动物包括人体中。

研究发现，抗菌肽具有广谱抗菌活性以及快速杀菌特性，对于抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、囊膜病毒和肿瘤细胞有不同程度的抑制及杀伤效果，并且能通过趋化树突状细胞、单核细胞和记忆T细胞，成为先天性免疫和获得性免疫反应之间的重要桥梁，能够启动获得性免疫系统从而提高机体对于微生物感染的抵抗能力。抗菌肽具有抑制肿瘤细胞生长，抑制胰高血糖素分泌等功效。

枯草芽孢杆菌由于其非致病性，对人畜无害，兼具完善的分泌系统，外源基因表达产物分泌能力强，以及良好的发酵基础，成为优良的原核外源蛋白表达宿主。但是受原始枯草菌株的高蛋白酶分泌量以及相对较低的基因表达水平局限，未受研究者广泛重视和使用。直至二十世纪八十年代中期一批蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌突变株相继问世，将胞外蛋白酶降低至原有的5%，使得这些蛋白酶缺陷株成为外源蛋白表达的理想宿主。同时，枯草芽孢杆菌自身具备多种优良条件适用于动物肠道环境，是畜禽饲料添加剂的优秀生物替代品。

因此，针对禽畜及水产品的安全需要，寻找不产生耐药性、无毒副作用、无污染及残留的绿色饲料添加剂是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于通过枯草芽孢杆菌WB600所携带质粒pHYSGA获得分泌的融合型抗菌肽GA，该融合型抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有一定抑菌活性，作为添加剂加入饲料中，饲喂鸡雏后表明该融合肽可以提高鸡雏体重增长率、提高鸡雏的免疫指标，可以成为禽畜、水产饲料中抗生素的优秀替代品。

本发明提供的融合型抗菌肽GA是由GST标签蛋白经肠激酶酶切位点连接抗菌肽AWRK6构成。

所述的抗菌肽AWRK6（SWVGKHGKKFGLKKHKKH）由18个氨基酸构成，分子量为2130.5，结构主要为α-螺旋，等电点为9.60。

本发明，根据抗菌肽AWRK6序列，通过Touchdown Booster PCR方法获得AWRK6全长基因，插入构建的大肠杆菌——枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，在枯草芽孢杆菌中进行诱导分泌表达。通过pcr方法获得谷胱甘肽转移酶（gultathione S transferases,GST）作为蛋白标签，以蔗糖果聚糖酶（Levansucrase）的启动子及信号肽序列（SacB p.s.,SacR）作为表达调控元件，连接并转入质粒pHY300-plk，获得穿梭载体pHYSGA。转化进入蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌WB600，进行诱导表达，获得融合型抗菌肽GA。具体制备方法如下：

1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；

所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；

所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；

2）制备GST标签蛋白序列；

3）按照SEQ ID NO.2所示的序列，设计6条引物pA1-pA6进行PCR pA1-pA6，获得AWRK6序列；

所述的引物pA1的序列是：TATTACCATTAATATGACGACGACGACAAGA；