[发明专利]DNA结合蛋白的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种DNA结合蛋白的检测方法。

背景技术

简单灵敏的检测人体细胞中转录因子对于临床诊断以及药物的筛选有着重要的意义。目前的检测方法都是基于电泳迁移，免疫化学或者是荧光检测的方法，这些方法都是通过非扩增而直接进行检测，因此灵敏度较低。而且这些方法存在着放射性污染或者需要特异性抗体和荧光标记的探针，大大增加了实验成本和实验的复杂性。

DNA结合蛋白在基因组复制，基因转录，细胞分裂和DNA修复过程中起着至关重要的作用。而大部分的DNA结合蛋白都扮演着转录因子的角色，调节着细胞的发育，分化和增殖，由此转录因子也已经成为临床诊断和药物筛选中的靶点。目前为止绝大部分都是采用非扩增的直接检测的方法来定量转录因子，其中包括电泳迁移法(EMSA)，DNA酶足迹法；酶联免疫吸附法(ELISA),免疫印迹法(western blotting)和基于荧光能量共振转移(FRET)的方法。其中电泳迁移法(EMSA)和DNA酶足迹法属于传统检测方法，都是利用同位素标记DNA探针和凝胶电泳分离来检测DNA-蛋白复合物。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(western blotting)是通过抗原和抗体的特异性反应，然后经酶标抗体的底物显色反应来检测DNA结合蛋白。基于荧光能量共振转移(FRET)的方法则是利用DNA与蛋白的相互作用，使标记有荧光的两段DNA探针相互靠近而发生FRET;或者是标记有荧光的DNA探针与蛋白的相互作用后对DNA序列起到保护作用，外切酶Exo III不能进行切割DNA探针从而发生FRET，以此来检测DNA结合蛋白。然而，传统的DNA结合蛋白的检测方法灵敏度都偏低。

发明内容

基于此，有必要提供一种灵敏度较高的DNA结合蛋白的检测方法。

一种DNA结合蛋白的检测方法，包括如下步骤：

提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液，在Exo III存在的条件下进行消化反应，反应完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反义链作为引物被保留在所述消化液中；

将所述消化液加入到扩增体系中，在聚合酶、内切酶和扩增模板存在的情况下，进行等温扩增反应，反应完全后得到扩增液，其中，所述扩增模板包括n段重复序列以及n-1段依次连接所述重复序列的连接序列，所述引物与所述重复序列特异性结合，所述连接序列包括所述内切酶的酶切位点，n为不小于2的整数，所述引物扩增后得到所述扩增模版的互补序列，所述扩增模版的互补序列被所述内切酶切割形成n段包含所述重复序列的靶DNA；

提供纳米金颗粒溶液，并将所述纳米金颗粒溶液与含有第一检测探针和第二检测探针的溶液混合后进行孵育，孵育完成后得到纳米金检测探针溶液，其中，所述第一检测探针与所述靶DNA特异性互补，所述第二检测探针与所述靶DNA特异性互补；

将所述扩增液和所述纳米金检测探针溶液混合，反应完全后对混合液进行检测，完成所述DNA结合蛋白的检测。

在一个实施例中，所述提供待检测的DNA结合蛋白的样品溶液的操作为：

将HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，置于加湿处理的含有5%二氧化碳的37℃培养箱中，加入20纳克每毫升TNF-α进行刺激，30分钟后用细胞核提取物试剂盒裂解细胞，收集细胞提取物即为所述待检测的DNA结合蛋白的样品溶液。

在一个实施例中，所述DNA结合蛋白为NF-κB p50蛋白。

在一个实施例中，所述聚合酶为KF聚合酶，所述内切酶为Nb.BbvCI内切酶。

在一个实施例中，n=2。

在一个实施例中，所述纳米金颗粒溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备得到。

在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为：肉眼直接观察，混合液中的纳米金检测探针发生聚集，颜色由红色变为紫色。

在一个实施例中，对所述混合液进行检测的操作可以为：采用分光光度计检测混合液，光谱采集范围为410nm～800nm，检测最大吸收峰。

在一个实施例中，所述作为引物的DNA的反义链的序列为SEQ ID No.1所示的序列。

在一个实施例中，所述扩增模板的序列为SEQ ID No.2所示的序列；

所述第一检测探针的序列为SEQ ID No.3所示的序列；

所述第二检测探针的序列为SEQ ID No.4所示的序列。