[发明专利]一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

丙型肝炎病毒（hepatitis C Virus,HCV）感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康，我国是HCV高感染率国家之一，目前的治疗手段有限，尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗。

HCV为单链正义RNA病毒，其基因表达产物为含3011个氨基酸的多聚蛋白，经蛋白酶剪切后形成多种蛋白（核衣壳蛋白Core、包膜蛋白E1和E2；离子通道蛋白P7；非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）（Pwalotsky JM,Gastroenterology,2002,122(6):1554-1568）。E2蛋白对应于多聚蛋白链中的氨基酸序列是384～746氨基酸。HCV包膜糖蛋白为病毒外壳的主要成分，在感染中发挥着重要的作用：参与病毒蛋白粒子的装配、与肝细胞表面受体结合相互作用介导病毒进入，并且，E2是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E2区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点（Fournillier,et al.J.Virol,2001;75:12088），此外，E1、E2含有T、B细胞表位，可以诱导保护性免疫反应，是保护性抗原。

E2是高度糖基化的蛋白，糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。E2上含有11个N-糖基化位点，并且尽管不同基因型HCV中包膜蛋白E2的氨基酸序列具有可变性，这些糖基化位点却是高度保守的（Goffard,A et al..J.Virol,2005,79:8400-8409;Slater-Handshy et al,Virology,2004,319(1):36-48），这意味着这些糖基化修饰是HCV生活周期中起重要作用。对这些聚糖的功能分析表明：糖基化修饰在蛋白质折叠、HCV进入中起关键作用，同时寡糖链可以保护病毒的包膜蛋白被宿主细胞的蛋白酶降解，还可以遮蔽病毒抗原，使机体不能有效识别病毒，保护病毒抵抗抗体中和作用，例如：E2上423和448（E2N2和E2N4）位糖基化位点突变明显减少HCVpp（HCV假病毒）的感染性，417，532和645位的糖基化修饰（E2N1，E2N6和E2N11）能够保护HCVpp以及HCVcc（HCV cell culture，细胞培养病毒）抵抗抗体的中和作用（Reviewed by Helle,viruses,2011）。另一方面，通过除去病毒包膜蛋白的糖苷还可以改变蛋白的免疫原性，研究表明，E1的209位糖基化位点突变后，可以诱导更强的细胞免疫反应，305位突变可增强体液免疫，E2的576位突变可显著增强特异性细胞免疫反应。但是E2上与中和性抗体表位惜惜相关的糖基化修饰位点N1/N2/N4/N6/N11去除后能否在体内诱导产生抗HCV中和抗体（neu-IgG）仍不清楚，并且这些位点中N-聚糖删除能否在体内介导产生强的细胞免疫反应国内外均未见报道。