[发明专利]实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针及方法有效
申请号: | 201310418647.1 | 申请日: | 2013-09-16 |
公开(公告)号: | CN103451304A | 公开(公告)日: | 2013-12-18 |
发明(设计)人: | 刘金华;史艳宇;刘韬;孟日增;聂丹丹 | 申请(专利权)人: | 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64 |
代理公司: | 长春市东师专利事务所 22202 | 代理人: | 张铁生 |
地址: | 130062 吉林*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 实时 荧光 pcr 检测 貉子 成分 引物 探针 方法 | ||
技术领域:
本发明属食品检验技术领域,确切地说是一种实时荧光PCR检测用引物,探针以及利用该引物探针,及对貉子源性成分进行鉴别检测的方法。
背景技术
目前,国内外应用于检测食品和饲料中所含动物成分的技术主要有二种: ELISA方法及PCR特异扩增法,在实际检测中应用最多的是PCR特异扩增法,PCR特异扩增法又有普通定性PCR,实时荧光PCR。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的,在扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,即检测靶核昔酸序列扩增状态,以进行结果判定它的主要优点是: (1)在闭管状态下进行扩增产物检测,无需PCR产物的后处理,避免了扩增产物污染而致的假阳性,保证了结果的可靠性;(2)探针杂交特异性更强,灵敏度更高,在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针,提高了特异性,荧光信号由仪器自动收集,进一步提高了灵敏度;(3)无需酶切位点存在,无需进行酶切,电泳,节省了时间,PCR后无需后续处理,操作更简单快速;
在动物产品原料和加工产品中,经常出现动物成分的掺假造假和无意污染现象,掺假主要是不法商要降低成本或增加品质,以谋取巨额的经济利益,在食品和饲料的加工过程中,以低价格的原料替代高价格的原料或掺入到高价格的原料中,这是一种欺诈行为掺假造假的欺诈行为,被我国多部法律法规禁止 。貉子作为一种毛皮动物,在杀完去皮张之后,往往将耗子肉贱卖给不法商贩,不法商贩往往某些价格较高的畜肉制品中却添加有貉子肉,以次充好。由于没有相应的引物、探针,迄今为止还没有对畜肉食品中貉子源性成分的定性检测方法,以至于不能及时发现畜肉食品中貉子源性成分的存在,这种掺假造假,以次充好的行为除了影响影响人体健康、严重损害了消费者的利益。
目前我国还没有相应方法对食品和饲料中的猫源性成分进行检测也就是说,食品和饲料中的貉子源性成分检测仍处于空白状态建立食品和饲料中貉子源性成分检测方法,对于打击假冒伪劣食品,保障消费者权益和身体健康,保护我国畜牧业安全和经济利益,避免国际贸易纠纷等方面具有十分重要的意义,是迫在眉睫要解决的食品安全问题和检验检疫问题。综上所述,鉴于目前尚没有快速简便地检测和鉴定貉子源性成分的检测技术,因此,本领域迫切需要开发新的快速简便地检测和鉴定貉子源性成分的技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针及方法。
实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针,分别为:
上游引物Pl:CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC
下游引物P2:GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA
带有荧光染料的探针序列为: CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC
所述的荧光染料,5′端为FAM标记,3′eclipse标记。
实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法,其步骤如下:
a.提取待检样品基因组DNA;
b.以所提取的DNA作为模板,加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应,记录样品反应的Ct值;
所述的实时荧光PCR反应体系为:
2×Real-time PCR预混液 10μL
上游引物(10 μmol/L) 1μL
下游引物(10 μmol/L) 1μL
探针(10 μmol/L) 1μL
样品DNA(1~100 ng/μL) 2μL
ddH2O 5μL
所述的实时荧光PCR反应条件为95℃10min,1个循环;95℃,15s,60℃30s,40个循环,
所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照,判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照b和c所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非貉子源性物种基因组DNA为模板,按照b和c所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以貉子基因组DNA为模板,按照b和c所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于34;
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