[发明专利]裂开型核酸适配体探针及其在肿瘤细胞检测、捕获与释放中的应用方法

权利要求书

1.一种裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述探针包括将完整的核酸适配体序列在适当位点分裂后形成的两条核酸片段，设为片段a和片段b；所述完整的核酸适配体序列具有对靶肿瘤细胞的特异性识别能力，所述适当位点是指在该位点对完整的核酸适配体序列进行分裂后的核酸片段仍能保持对靶肿瘤细胞的特异性识别能力；所述片段a和片段b在没有靶肿瘤细胞存在时不会发生相互作用，当体系中引入靶肿瘤细胞时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞发生特异性结合，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合必须在片段a和片段b同时存在时才能发生。

2.根据权利要求1所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合具有温度敏感性，即片段a和片段b与靶肿瘤细胞在0℃～8℃共培育时发生特异性结合，当温度上升至37℃或37℃以上时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞全部解离；所述片段a和片段b与靶肿瘤细胞的特异性结合和解离具有可逆性。

3.根据权利要求1或2所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述完整的核酸适配体序列是指通过指数富集的配体系统进化技术筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适配体。

4.根据权利要求3所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述完整的核酸适配体序列是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞具有特异性识别能力的核酸适配体序列，所述完整的核酸适配体序列的核苷酸序列为：

5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’；

所述完整的核酸适配体序列裂开后形成的片段a和片段b的核苷酸序列分别为：

片段a：5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3’；

片段b：5’-TAC TGT ACG GTT AGA-3’或5’-CTG TAC GGT TAG A-3’。

5.一种如权利要求1～4中任一项所述的裂开型核酸适配体探针用于肿瘤细胞检测的方法，包括以下步骤：

（1）在片段a的5’端、片段b的3’端分别连接荧光供体和荧光受体，或者在片段a的3’端、片段b的5’端分别连接荧光供体和荧光受体；

（2）向待测细胞溶液中加入5’端连接有荧光供体的片段a和3’端连接有荧光受体的片段b，或者加入3’端连接有荧光供体的片段a和5’端连接有荧光受体的片段b，混匀后于0℃～8℃下共培育90分钟，并采用阴性细胞溶液进行相同操作作为阴性对照；

（3）对上述共培育后的阴性细胞溶液和待测细胞溶液分别进行流式细胞术分析，即采用流式细胞仪激发荧光供体、收集荧光受体的信号，并对收集到的细胞群的荧光受体信号强度进行统计分析；在相同检测参数下，当阴性细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率小于或等于5%、待测细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率大于或等于10%时，即认为待测溶液中有目标肿瘤细胞被所述裂开型核酸适配体探针检出。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光供体和荧光受体之间存在荧光共振能量转移效应；所述荧光供体和荧光受体组成荧光供受体对，所述荧光供受体对包括FITC-TMR、FAM-TMR、Alexa488-TMR、Atto550-Atto647或Cy3-Cy5。

7.一种如权利要求1～4中任一项所述的裂开型核酸适配体探针用于温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法，包括以下步骤：

（1）将片段a的5’端先插入连接片段后再修饰第一功能团，在一捕获容器底部修饰第二功能团，通过第一功能团与第二功能团之间的相互作用将带有连接片段的片段a固定至捕获容器底部，得到固定有片段a的捕获容器；

（2）将待捕获细胞样品与片段b一起加入上述固定有片段a的捕获容器中，于0℃～8℃下共培育90分钟，去除上清液并洗涤捕获容器后，靶肿瘤细胞即可从待捕获细胞样品中分离出来并被捕获至捕获容器的底部；

（3）将上述捕获有靶肿瘤细胞的捕获容器置于25℃～40℃培育60分钟后取出上清液，即得到含有单纯靶肿瘤细胞的溶液。