[发明专利]一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1及其构建方法

权利要求书

1.一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1， Bacillus sphaericus，保藏编号为CGMCC NO.7519。

2.权利要求1所述的一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1的构建方法，依次包括以下步骤：

亲本菌体活化

将菌株T1、F8分别转接至平板划线分离2次，转接至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中分别培养24h、16h至对数期；

亲本原生质体制备

T1菌株按照以下步骤进行：

a、菌体重悬：取4 ml活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次；

b、酶解：用1.8ml的SMM缓冲液重悬，加入1 mg/mL的溶菌酶0.2ml和2 ml加热至酶解温度的EDTA溶液，使得体系酶浓度达到0.05 mg/mL，在水浴温度30℃条件下酶解1 h；

c、原生质体重悬：3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 ml 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；

F8菌株按照以下步骤进行：

a、菌体重悬：将4 mL活化的菌液4500 r/min离心10 min，以SMM缓冲液洗涤2-3次后用SMM缓冲液重悬；

b、酶解：加入溶菌酶使得体系浓度达到5mg/L，水浴温度为33℃，保温酶解时间为30min；

c、原生质体重悬：3000 r/min离心后以0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤原生质体2-3次，再用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液重悬原生质体；

亲本原生质体灭活

将F8菌株的原生质体悬浮液放入水浴锅中恒温45℃保温30min灭活，分别采用热灭活与紫外灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活；

其中，采用紫外灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活，用紫外灯（12W）进行照射，与点光源距离15cm，照射60min；采用热灭活方式对T1菌株原生质体进行灭活，灭活温度分别为45、50、55、60℃，时间30min；

亲本原生质体融合

将不同灭活方式处理后的两亲本原生质体各取1mL于5mL灭菌离心管中，混匀后3800rpm离心20min，弃去上清液，加入新生磷酸钙溶液0.2mL并摇匀，加入1.8mL30%的PEG4000，酸碱度为8.0，30℃融合30min，后3800rpm离心10min，弃去上清液，用SMM溶液定容至2mL；

双效工程菌融合子的传代与筛选

将步骤（4）中的双效工程菌菌悬液梯度稀释后选取合适浓度涂布于高渗培养基，30℃恒温培养48h，观察细菌形态、大小，挑取不同形态大小的菌落重新转接至平板，划线分离4次，30℃恒温培养48h，观察菌落形态，以游标卡尺测量菌落直径并求平均值；

对挑选出的大于亲本直径的菌株进行溶藻实验和藻毒素降解实验，F8和T1菌株为对照组；

溶藻实验以1：10的菌藻比，12h：12h光照条件进行。

3.根据权利要求1所述的一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1的构建方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的细菌培养基组成如下：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述的一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1的构建方法，其特征在于其中步骤（5）中所述的高渗液体培养基组成如下：蛋白胨 10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g（0.5 mol/L），蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20-24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。