[发明专利]一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于蓝藻处理的微生物学领域，具体涉及一种溶藻/藻毒素降解双效工程菌的构建方法。

背景技术

过量的N、P等物质进入水环境，水体接受的营养物质超过自身的净化能力，导致蓝藻等浮游植物过量繁殖，有浮力的浮游蓝藻在水体表面的聚集，发生“水华”现象。此外，某些蓝藻如铜绿微囊藻，其在繁殖过程中产生大量藻毒素储存在细胞内，随着藻细胞的死亡释放出来，以溶解性的状态存在于水中，严重威胁动物以及人类的健康。目前已被发现的藻毒素种类大约为80多种，其中毒性最大、含量最多的是MC-LR。

目前，国内外专家学者普遍认为生物法是解决蓝藻水华问题最为有效、安全、经济的方法，很多研究人员发现在暴发蓝藻的天然水体、水库、池塘、除藻装置等不同环境中都存在着能够溶解或感染蓝藻细胞的微生物，它们主要归属于假单胞菌属、芽孢杆菌属等，并将统称为溶藻细菌，但是溶藻细菌的研究尚处于实验室阶段，并未规模性的应用于实际工程中，而系统的研究溶藻细菌的溶藻特性，寻找细菌的最佳溶藻条件，探索细菌溶藻方式，可为蓝藻水华生物防治工作提供一定的技术基础，此外，细菌溶藻导致的藻毒素问题也逐渐被人们所重视。一系列具有藻毒素降解功能的藻毒素降解菌逐渐被人们分离出来用于处理藻毒素污染。

利用微生物溶藻，溶藻菌溶解蓝藻细胞后，胞内的藻毒素会被释放出来，这就需要藻毒素降解菌配合使用，但由于各种菌株的生活习性不同，对环境的要求不一致，构建一个既能溶藻又能解决其衍生的藻毒素污染问题的复合菌群，并使之适应环境，较为困难。利用原生质体融合技术将具有溶藻与藻毒素降解功能的亲本菌株进行融合构建兼具双亲优良性状的双效工程菌，将同步解决溶藻及其衍生的藻毒素污染问题变为可能，目前，国内外学者对于以原生质体融合技术构建兼具溶藻与藻毒素降解功能的双效工程菌的研究较少。

基于上述情况，本发明对溶藻细菌进行原生质体制备和再生、原生质体灭活并在此基础上进行原生质体融合试验，制备出既能溶藻又能降解MC-LR的双效工程菌。

其中，T1为本课题组从太湖河浜底泥中分离筛得的MC-LR降解菌，为球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），16S rDNA序列已提交至GenBank数据库，获得的16S rDNA基因登陆号为HQ877618，该菌已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.4498。实验方法与结果已申请专利，专利名称为《微囊藻毒素降解菌株及利用其降解MC-LR的方法》，已获得授权（批准号：2012061900548110），其原生质体制备与再生条件适宜参数已申请专利，专利名称为《一种降解MC-LR的芽孢杆菌原生质体制备与再生的方法》（201210342202.5.）

F8为本课题组从太湖流域野生白鲢鱼肠中筛选的溶藻细菌，为梭状赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），在美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank中注册序列号JQ991003，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CGMCC NO.6106。实验方法与结果已申请专利，专利名称为《溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法》（201210275810.9）。其原生质体制备与再生条件适宜参数已申请专利，专利名称为《一种可溶藻的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生方法》（201210342222.2）。

发明内容

本发明的目的在于解决蓝藻水华及其衍生的藻毒素污染问题，鉴于溶藻菌溶解蓝藻细胞后，胞内的藻毒素会被释放出来，溶藻细菌与藻毒素降解菌配合使用时各种菌株的生活习性不同，对环境的要求不一致，构建一个既能溶藻又能解决其衍生的藻毒素污染问题的复合菌群，并使之适应环境，较为困难。因此，本发明的内容为利用原生质体融合技术将具有溶藻与藻毒素降解功能的亲本菌株进行融合构建兼具双亲优良性状的双效工程菌，同步解决溶藻及其衍生的藻毒素污染问题。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种通过原生质体融合技术融合出的溶藻/藻毒素降解双效工程菌Y1，经鉴定其属于球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），并于2013年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO.7519。

本发明的目的是通过以下步骤来实现的。

本发明利用原生质体融合技术构建溶藻/藻毒素降解双效工程菌的方法，依次包括以下步骤：

（1）亲本菌体活化