[发明专利]一种筛选原肌球蛋白相关激酶B抑制剂高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对TrkB激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

TrkB是BDNF最主要的受体，具有受体酪氨酸激酶的活性。研究显示，BDNF和TrkB在多种人类肿瘤中表达上调，包括膀胱癌和卵巢癌等。而在具有高转移潜能的胰腺癌细胞中发现TrkB过表达，这提示TrkB可能介导了胰腺癌侵袭性生长和转移的临床特征。TrkB经BDNF活化，诱导下游一系列信号通路分子的活化，如蛋白激酶B(protein kinase B，PKB又称Akt和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，同时可调节多种细胞生物学行为，如细胞增殖和凋亡等。因此，研究TrkB激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种TrkB激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选TrkB激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的TrkB激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外TrkB激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制TrkB激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种TrkB激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：TrkB激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：TrkB激酶浓度梯度优化实验结果。(n=3，±S)

图2：TrkB激酶温孵时间优化实验结果。(n=3，±S)

图3：TrkB激酶底物浓度优化实验结果。(n=3，±S)

图4：TrkB激酶ATP浓度优化实验结果。(n=3，±S)

图5：阳性药十字孢碱对TrkB激酶的抑制曲线图。(n=3，±S)

图6：TrkB激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.TrkB激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

TrkB激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、TrkB激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Coming，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行TrkB激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol／L。

3)在反应容器中每孔加入TrkB激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。

4)每孔加入Estradiol-XL665 5μl，Anti-Estradiol-cryptate 5μl，室温孵育1小时。