[发明专利]一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)HA校准品；2)HA-巯基磁珠连接物试剂；3)酶结合物；4)化学发光底物；5)清洗液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的HA-巯基磁珠连接物试剂的主要成份是HA偶联巯基磁珠连接物。

3.如权利要求2所述的HA偶联巯基磁珠连接物，其特征在于所述巯基磁珠粒径为1μm-4.5μm，表面活性基团为巯基(-SH)。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶结合物的主要成份是碱性磷酸酶标记的透明质酸结合蛋白。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的所述的化学发光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐)。

6.一种制备权利要求1中所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)配制透明质酸校准品；

2)将透明质酸连接到巯基磁珠上制备连接物，用磁珠缓冲液稀释连接物到一定浓度，制备出连接物试剂；

3)用酶标记透明质酸结合蛋白，制备酶结合物；

4)配制化学发光底物；

5)配制清洗液；

6)分装以上各试剂，组成成品。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述HA-巯基磁珠连接物试剂的制备过程包括以下步骤：

1)准确称取透明质酸5mg，溶解于纯水中，终浓度为0.5mg/ml；

2)在上一步的透明质酸溶液中加入1M NaOH溶液使溶液pH达到10±0.1，室温水解8-10小时，将透明质酸分子中的酰胺基进行水解，使其暴露出伯氨基(-NH₂)基团，反应过程中充分混匀；

3)将反应后的透明质酸溶液用透析袋透析2小时，除去溶液中的NaOH，然后浓缩至约2mg/ml；

4)按照如下方法配制pH＝7.0的50mmol/l的磷酸盐缓冲液：称取NaH₂PO₄·H₂O2.69g，Na₂HPO₄·2H₂O5.43g，NaCl5.85g，加入800ml纯化水，用1M盐酸或氢氧化钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

5)配制10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解；

6)将浓缩后的透明质酸溶液中加入50μl10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)进行活化，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

7)量取5mg巯基磁珠，将巯基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为25mg/ml；

8)将活化后的透明质酸溶液加入清洗后的巯基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为2mg/ml，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

9)按照如下方法配制磁珠缓冲液：称取Tris碱12.11g，NaCl8.78g，0.5ml吐温-20，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1。加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

10)反应完成后移除上清，用50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存。使用时用磁珠缓冲液稀释100倍即为工作液，浓度为0.05mg/ml。