[发明专利]一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，下文简写为HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成线形多糖结构，由间质细胞合成，经淋巴循环进入血液，半衰期为2.5-5.5分钟，由特异性的透明质酸酶水解，代谢部位主要在肝脏。研究发现，肝组织病理的变化与血清中透明质酸的浓度变化密切相关，因此，通过检测血清中透明质酸含量的变化可以检验肝组织受损程度。

透明质酸的线性多糖重复结构使它的分子量分布很宽，对于透明质酸的分析检测己知的方法有很多，包括分光光度法、荧光分析法、凝胶高效液相层析法、电化学分析法、共振瑞利散射法和免疫分析法等，其中免疫分析法由于其灵敏度高、特异性强、对临床样本适用性强等特点而在各种方法中脱颖而出，在临床的透明质酸检测中得到了广泛的应用。

免疫分析法也有多种检测原理和方式，最初HA的免疫检测是使用放射免疫，但很快由于放射免疫的污染、操作复杂等局限性而被酶联免疫法和化学发光免疫法所取代，目前市场上的透明质酸检测试剂盒最常见的检测方式为免疫竞争法检测(无论是酶联免疫还是化学发光免疫)，具体步骤一般是：将待测样本中加入到包被有透明质酸的微孔板中，再加入一定量透明质酸结合蛋白(Hyaluronic acid binding protein，下文简写为HABP)，微孔板上包被的透明质酸和样本中待测的透明质酸竞争与HABP结合，形成固相HA-HABP复合物，再加入酶标记的抗HABP的抗体进行反应，形成固相HA-HABP-抗HABP抗体-酶的复合物后最后加入底物测定发光值或者吸光值，最后通过定标液曲线测定样本浓渡。这种方法主要存在如下两个问题：

1)在固相载体(例如微孔板)上包被HA，所采用的方式是将HA与大分子蛋白(例如：牛血清白蛋白，下文简写为BSA)连接形成复合物，利用96孔板吸附大分子蛋白的特性在96孔板上包被HA-蛋白复合物，由于HA属于线性多糖结构，在与大分子蛋白连接后，HA的特征性结构会很大程度上被大分子蛋白所包裹，影响它与HABP结合的亲和力和稳定度，对检测灵敏度造成影响；

2)为保证各组份之间反应完全，需要将HABP及抗HABP抗体分步加入，存在反应体系中参与反应的成份多、检测步骤繁琐、检测时间长的缺陷，同时试剂灵敏度和稳定性也受反应步骤多、反应体系成份多的影响进一步降低。

除了上文介绍的最常见的透明质酸免疫竞争法之外，近年来透明质酸免疫检测方法还有：

1)将铕标记引入免疫竞争法体系的透明质酸检测方法：

专利CN102095847A公开了一种一步法检测血清、体液或组织匀浆中透明质酸(HA)含量的方法：在固相载体(例如96孔微孔板)上包被HA-BSA，在HABP上标记铕(Eu³⁺)，反应体系中与样本中的HA共同与限量的HABP-Eu³⁺在适宜的条件下进行竞争性结合反应，形成一种HA-HABP-Eu³⁺结合物。校准品或样本中HA含量越高，在包被板上形成的HA-HABP-Eu³⁺结合物就越少。加样时只需向微孔中连续加入样本及HABP-Eu³⁺，反应1小时即可完成。Eu³⁺的荧光强度随样本中HA浓度的增加而减少，因此可以计算出HA的准确含量。此专利通过一步法克服了上述常见免疫竞争法的方法的第2个问题，即步骤繁琐、时间长、反应体系成份多，但仍未解决第1个问题，即HA与大分子BSA连接后再包被所造成的HA特征性结构被包裹降低灵敏度的问题。

文献《时间分辨荧光免疫分析检测血清透明质酸方法的建立和临床应用》(《中华检验医学杂志》，2006年6月第29卷第6期，p533～534)中也介绍了采用铕标记的试剂盒，但与专利中的区别是，在文献中铕标记的是HA-BSA，包被的是羊抗兔多抗，同时文献方法在实验过程中未使用一步法，而需要加入兔源抗HABP抗体，再加入HABP，再加入待测样品，反应步骤极其复杂，因此常见免疫竞争法的两个缺点此方法均存在。

2)将HABP和抗HABP酶连接物合并反应成HA酶结合物，引入免疫竞争法体系的透明质酸检测方法：