[发明专利]优化的牛凝乳酶原基因及其分泌表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及优化的凝乳酶原基因，尤其涉及将来源于牛凝乳酶原基因进行密码子优化后所得到的凝乳酶原基因，本发明还涉及优化的凝乳酶原基因在生产凝乳酶中的应用，属于重组凝乳酶的制备领域。

背景技术

干酪营养丰富,味道鲜美,贮存期长且种类繁多,是世界食品中的重要组成部分,素有“乳制品之王”之称。在干酪的生产工艺过程中,凝乳是影响干酪产率和品质的关键性工艺。凝乳酶（chymosin，EC3.4.23.4）是制造干酪的凝乳过程中起凝乳作用的关键性酶，它是天冬氨酸蛋白酶中的一种，能够专一性裂解k-酪蛋白中的Phe_105-Met₁₀₆肽键，引起乳蛋白凝聚，在乳制品特别是干酪加工中具有重要作用，同时凝乳酶对干酪的质构和特有风味的形成起着非常重要的作用。

传统的凝乳酶主要是通过宰杀未断奶小牛从其皱胃中提取，凝乳酶在小牛皱胃中以含381个氨基酸的前体聚肽—凝乳酶原前体的形式合成，在分泌过程中，会去掉16个信号肽形成含有365个氨基酸的凝乳酶原，大小为40.8kDa。凝乳酶原无活性，在酸性条件下会自动催化，去掉N端42个氨基酸形成有活性的凝乳酶，该酶含有323个氨基酸，大小为35.6kDa。随着干酪产业的剧增，小牛皱胃提取的凝乳酶无法满足需求。目前使用较多的代替品主要是羊、猪和鸡的胃蛋白酶，但是这些酶都具有较强的蛋白分解能力，单独制作的干酪都会存在出现苦味、凝乳时间长、质地较软，出品率低等问题。近年来，一些研究者也从水生动物中提取到了凝乳酶，如鳖鱼胃粘液中发现具有凝乳活性的酸性蛋白酶，Kristinsson等人从海豹的胃和胃粘液中提取出一种在pH值为6.0-6.8范围内有很好凝乳活性的蛋白酶，用该蛋白酶制造出的干酪风味正常，适合商业化生产，是牛皱胃酶的潜力替代品。

尽管研究人员发现了一些动物源的牛凝乳酶替代品，但动物资源仍不如植物和微生物丰富，因此，各国学者纷纷将研究目标转向植物和微生物源凝乳酶。许多植物蛋白酶都具有凝乳的功能，主要分布在植物的果实、叶、茎和根等部位。世界凝乳酶中这类酶用量约占1%左右。目前已报道的植物来源凝乳酶主要为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、合欢树蛋白酶等。由于动物和植物来源凝乳酶的局限性，微生物凝乳酶逐渐被人们所关注和研究。微生物源的凝乳酶具有来源广泛、生长周期短，产量大、便于提取、利于工业化大规模生产等优势。迄今未止，已有40多种微生物可产生具有一定凝乳活力的蛋白酶，主要是细菌、放线菌和真菌。目前应用最多的微生物来源凝乳酶是由微小毛霉（Mucor pusillus）产生的，该酶的蛋白分解能力比牛凝乳酶强，但比其它来源的蛋白酶弱。其它常见的用于产凝乳酶的微生物有米根霉（Rhizopus oryzae）、寄生内坐壳菌（Endothaparasitisa）、根毛霉属（Rhizomucor）等。与植物来源凝乳酶相比，微生物来源的凝乳酶制作的干酪的质量和品质都有所提高，但在正常巴氏杀菌条件下，因其较高的耐热性，会造成乳清中蛋白酶活性较高，影响后期工作。与牛凝乳酶比较后，其凝乳酶活性与蛋白酶活性比值(c/p)仍然偏低，干酪质量较差，且成熟干酪风味也有所改变，还会伴随苦味。