[发明专利]一种检测人EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术

EGFR是（HER-1/ErbB1）一种TK受体蛋白，属于ErbB家族，此受体蛋白在肿瘤发生发展中发挥着主要的功能。在癌细胞表面，EGFR的活化启动了RAS-抗凋亡反应，细胞生长，存活，细胞周期的进展，分化及血管生成的活化。EGFR突变好发于女性，年龄相对较轻，肺腺癌患者中，突变集中在为18，19，20，21号外显子，有缺失，amplification，点突变等，在40-80%非小细胞肺癌患者中表达。大型的全球多中心临床研究（IPASS研究）表明如果病人肺癌组织中存在EGFR基因18，19，20，21号外显子突变，即使化疗无效时，使用TKIs类药物（酪氨酸激酶抑制剂）进行靶向治疗，如吉非替尼（gefitinib）/厄洛替尼（erlotinib），可以明显改善其症状，延长其存活率等。因此检测癌症中的EGFR外显子18，19，20和21的突变尤为重要。

发明内容

EGFR基因最常见的突变位点见于18,19,20和21外显子，这些突变可发生在许多人类肿瘤中，本发明解决上述技术问题提供一种检测人EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法，本发明采用基于实时序列检测的焦磷酸测序技术对上述突变进行检测本试剂盒在检测EGFR基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。

本发明试剂盒包含4套PCR引物，扩增EGFR外显子18，19，20和21。外显子18PCR扩增产物检测密码子719突变；外显子19PCR产物检测外显子19缺失突变；外显子20PCR产物检测密码子768和790突变；外显子21PCR产物检测密码子858和861。每套PCR引物中均有一条引物标记了生物素的引物，它能保证在测序反应中正确分离出待测DNA链。同时，本试剂盒还含有5条不同的测序引物，分别用于检测719密码子，768，790，外显子19缺失部分碱基序列，858和861突变。它们用于后续的焦磷酸序列分析中检测上述最常见的突变。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测人EGFR基因突变的试剂盒，包括如下扩增引物和测序引物：

1）扩增引物：

EGFR外显子18F：5′-ATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTG-3′（SEQ ID NO.1）；

EGFR外显子18R:5′-CCTTATACACCGTGCCGAACGCACC-3′（SEQ ID NO.2），5′端生物素标记;

EGFR外显子19F：5′-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3′（SEQ ID NO.3）；

EGFR外显子19R:5′-GCAGCTGCCAGACATGAGAAAAG-3′（SEQ ID NO.4），5′端生物素标记;

EGFR外显子20F：5′-ACCATGCGAAGCCACACTGACGT-3′（SEQ ID NO.5）；

EGFR外显子20R:5′-TTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA-3′（SEQ ID NO.6），5′端生物素标记;

EGFR外显子21F：5′-GTGAAAACACCGCAGCATGTCAA-3′（SEQ ID NO.7），5′端生物素标记；

EGFR外显子21R:5′-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTT-3′（SEQ ID NO.8）;

2）测序引物：

EGFR外显子18：5′-ATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG-3′（SEQ ID NO.9），检测密码子719；

EGFR外显子19：5′-ATTCCCGTCGCTATCAA-3′（SEQ ID NO.10），检测外显子19缺失部分碱基序列；

EGFR外显子20：5′-AGGAAGCCTACGTGATGGC-3′（SEQ ID NO.11），检测密码子768；

EGFR外显子20：5′-CCACCGTGCAGCTCATCA-3′（SEQ ID NO.12），检测密码子790；

EGFR外显子21：5′-TTCTTCTCTTCCGCACCCAG-3′（SEQ ID NO.13），检测密码子858和861。

其中，F：正向引物，R：反向引物。

试剂盒中的其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

本发明还提供了一种应用如上述的试剂盒检测人EGFR基因突变的方法，包括：