[发明专利]一种有效获取血清小分子代谢物信息的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和代谢组学应用领域，是一种基于气相色谱-质谱选择离子扫描技术和重叠峰去卷积技术有效获取血清小分子代谢物信息的方法。

技术背景

目前，色谱质谱联用技术是复杂生物体系代谢组学研究的主流技术，其中，气相色谱-质谱联用技术具有高效的代谢物分离、定性性能。生理代谢途径中具有重要生理功能的极性小分子，如：丙酮酸，乳酸，磷酸烯醇式丙酮酸，乙醇胺，甘油酸，甘氨酸，丝氨酸等，通过衍生化后可在毛细管柱上实现高效的分离，并在质谱上得到有效的检测和定性。然而，由于生物体内代谢物间浓度分布范围可达10⁹，常规的气质联用检测方法远不能满足其线性范围，并且低丰度代谢物常被色谱流出时间相近的高丰度代谢物掩盖，导致其信息不能被有效提取。

本发明引入本实验室建立的拟靶向方法，其融合了SIM扫描方式的优势，与常规的全扫方式相比，具有数据更稳定、重复性更高、线性范围更宽，灵敏度更高、数据质量更高、无需峰匹配等特点。然而，拟靶向方法建立过程所采用的QC（质量控制）样本是所有样本的等量混合，直接以此QC样本获得的全扫数据来建立SIM扫描表，极有可能会遗漏高浓度样本中低丰度代谢物的信息。此外，在对自动质谱去卷积和鉴定系统（AMDIS，Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System）处理所得的色谱峰扫描点数据进行优化时，若相邻代谢物色谱流出时间差位于预先设定的扫描点间距内，相关代谢物的信息极有可能被遗漏。

针对现有的基于气质联用技术的拟靶向方法的不足，本发明主要进行了两方面的改进，以实现在不需要增加样品量的情况下，进一步丰富血清代谢物的信息。首先，通过改变仪器参数即增大进样量，减小分流比，以提高QC样本进入色谱柱的量。在此情况下，QC样本中各代谢物的离子质谱响应会增强，从而使得低丰度代谢物更容易被检出，有利于进行相关的定量和定性。另一方面，引入ChromaTOF4.43软件优越的去卷积功能，对重叠峰进行去卷积处理，进一步挖掘被相邻代谢物掩盖的低丰度代谢物信息。最后，将新增的定性代谢物特征离子添加于SIM扫描表中，再对样本进行采集。既提离了血清代谢物的鉴定数量，又保留了现有拟靶向方法的优势。本发明结合了气质联用、重叠峰去卷积和选择离子扫描技术，目前尚无将此方法应用于提高血清小分子代谢物信息的报道。

发明内容

本发明针对现有常规气质检测技术和拟靶向方法的不足，提出了一种结合了气质联用、重叠峰去卷积和选择离子扫描技术的方法，以期在不增加样品量的前提下，提高血清小分子代谢物的定性数量，同时保留拟靶向方法高灵敏度、重复性、稳定性、宽线性范围的特点，从而为其进一步推广提供基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种有效获取血清小分子代谢物信息的方法，

①制备待分析血清样本的质量控制样本（QC），经二步法衍生后，通过气质联用分析获得相应的质谱全扫数据，经AMDIS（自动质谱去卷积和鉴定系统）处理后，建立初始的SIM（选择离子扫描）表；②改变分析条件，增大进样量，减小分流比，获得相应的第二个质谱全扫数据，以获取更多低丰度代谢物的信息；③引入ChromaTOF软件的去卷积功能，分别对同一QC样本获得的两种全扫数据进行去卷积，代谢物定性后，找出新增定性的代谢物；④将新增定性的代谢物特征离子添加于初始SIM表，形成最终的SIM表，应用最终的SIM表对待分析血清样本进行选择离子扫描方式的气质联用分析，获得各个样本的代谢物含量信息。

于所述血清样本中加入内标后，再进行气质联用分析；获得各个代谢物的峰面积后，将各个代谢物的峰面积与内标峰面积的比值乘以10⁶，作为其在血清中的相对含量，即获得血清小分子代谢物的含量信息。

所述二步法衍生是将血清样本先经甲氧胺吡啶溶液进行肟化反应，再经N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺进行硅烷化反应，生成相应的衍生产物。

步骤①对衍生完的QC样本进行分析，获得质谱全扫数据后，经AMDIS处理，利用获得的各个代谢物的色谱保留时间，生成初始的SIM表，SIM表中包括QC样本中各个代谢物的色谱保留时间、峰的起点时间、落点时间、对应的特征离子，如表1所示。