[发明专利]人工抗菌肽MA-D4的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种人工抗菌肽MA-D4，其特征在于，其是具备序列表中SEQ ID No.1 所示氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID No.1 所示氨基酸序列经过环化、N末端和/或C末端修饰、L-型氨基酸和D-型氨基酸互相转变、序列末端缺失中的至少一种处理而得到的功能等同的多肽。

2.一种多核苷酸，其特征在于，其是具备序列表中SEQ ID No.2所示核苷酸序列或与之互补的多核苷酸，可编码SEQ ID No.1 所示氨基酸序列。

3.一种载体，其特征在于，具备权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，具备权利要求3所述的载体。

5.权利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的制备方法，包括如下步骤：

（1）根据GenBank中的抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID No.1，之后采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶识别位点，形成目的基因序列SEQ ID No.2；

（2）采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因，设计两两互补的4条PCR引物，通过多步PCR获得的目的基因；

（3）将获得的目的基因与原核表达质粒pET-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌；

（4）添加IPTG诱导基因工程菌表达，超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达量；

（5）使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肽MA-D4。

6.根据权利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制备方法，其特征在于，所述目的基因序列如SEQ ID No.2所示。

7.根据权利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制备方法，其特征在于，所述4条PCR引物序列如SEQ ID No.3~5所示。

8.权利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的应用，其特征在于，应用于制备抗菌剂。

9.权利要求8所述的人工抗菌肽MA-D4应用于制备抗菌剂，其特征在于，针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌。