[发明专利]人工抗菌肽MA-D4的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人工抗菌肽MA-D4的制备方法及其应用。

背景技术

抗生素长期在临床治疗上广泛地不恰当应用，使得许多病原菌产生了明显耐药性，现已成为威胁人类和动物健康的重大问题。更为严重的是临床上出现了多重耐药菌株，2010年发现的超级病菌NDM-1更是对绝大多数抗生素均不敏感。目前，开发一种新的抗生素一般需要10年左右，而产生一代耐药菌只需2年。抗感染形势非常严峻，开发设计新型抗菌药物已迫在眉睫。

 抗菌肽是一类由宿主产生的能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分，由特定基因编码产生。其生物功能具有多样性，除了具备广谱抗菌活性外，还具备抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫等生物活性。抗菌肽广泛存在于各种生物体内，在微生物、植物和动物中均有发现并成功分离获得。在适当的浓度下，抗菌肽能够与生物膜/壁组成成分或胞内细胞器等多种微生物靶位相互作用，前者破坏细胞质膜的完整性，后者干扰细胞的正常代谢活动，最终导致细菌死亡。更重要的是抗菌肽能作为免疫效应分子，启动和调节宿主免疫防御体系，保护宿主免受病原微生物侵害。抗菌肽独特的作用机理，使得其具有抗菌谱广泛、不易产生耐药性等特点，且对目前已产生耐药性的菌株同样可发挥作用。因此，抗菌肽或能替代传统抗生素药品，扭转抗生素应用的恶性循环，是一类具备广阔的市场前景和发展潜力的新型抗菌药物。

蛙类皮肤裸露、潮湿，是极好的微生物生存环境，但蛙类基于适应生存环境的需要，在长期的自然选择中，逐渐形成了防御机制，即由皮肤分泌多种结构特殊、功能多样的抗菌肽类物质，用以抵抗病原微生物的侵袭。从非洲爪蛙皮肤上发现的爪蟾抗菌肽Magainin，具有23个氨基酸残基，分子量约为2.5kD。其天然分离物在微克分子浓度下即可对多种细菌、真菌、原生生物、肿瘤细胞和病毒表现出杀伤作用。从叶泡蛙皮肤上发现的抗菌肽Dermaseptin-4，同样具有23个氨基酸残基，分子量约为2.5kD。其天然分离物可对多种细菌、真菌和原生生物表现出杀伤作用，尤其是致病性丝状真菌和酵母菌。

 生物体内抗菌肽含量较低，直接提取的工艺要求高，难度大，无法应用于规模化生产。人工化学合成虽可获得与天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正确的空间结构，且因存在昂贵的成本，使其目前仅停留在实验室试验阶段。通过基因工程途径合成人工抗菌肽是规模化生产制备的理想选择。除此之外，天然抗菌肽的生物活性不强、存在细胞毒性和溶血活性使其推广应用受到一定的限制。研究表明，杂合不同抗菌肽分子可以有效改善其生物活性，消除或降低其细胞毒性和溶血活性。迄今尚无将抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4杂合并进行高效表达的报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有天然抗菌肽生物活性低，且存在溶血活性的问题，提供一种具有高生物活性、无溶血活性的人工抗菌肽MA-D4，以及适用于规模化生产的基于大肠杆菌表达系统的高效制备方法，同时提供人工抗菌肽MA-D4针对多种细菌的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

根据GenBank中的抗菌肽Magainin（No. 474452717）和Dermaseptin-4（No. P84924.1）成熟肽氨基酸序列，人工设计出本发明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID No.1，采用大肠杆菌偏好性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列，并在两端分别添加核酸限制性内切酶识别位点，形成目的基因序列SEQ ID No.2。

采用重叠区扩增基因拼接法合成上述目的基因。设计两两互补的4条PCR引物，所述引物P1、P2、P3和P4分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，通过多步PCR获得目的基因。

将获得的目的基因与原核表达质粒pET-32a(+)连接，构建原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21或Rosetta中，筛选基因工程阳性菌。添加IPTG诱导基因工程菌表达，超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE，检测蛋白表达量。

使用肠激酶酶切处理表达产物后，通过镍离子亲和层析纯化获得本发明人工抗菌肽MA-D4。

通过微量稀释法测定人工抗菌肽MA-D4对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、猪链球菌2型和炭疽杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。

通过测定抗菌肽MA-D4针对小鼠红细胞的溶血率，判断其溶血性。

本发明具有积极有益的效果。