[发明专利]转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因植物品系特异性定量PCR检测方法，具体的说，涉及一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法。

背景技术

随着农业转基因生物技术的快速发展，全球转基因作物的种植面积迅猛增加。截止到2012年底，全球已有28个国家共种植了25种转基因作物，种植面积达到1亿7千3百万公顷，其中转基因玉米种植面积超过5500万公顷，占玉米种植面积的35%。尽管我国目前还没有批准转基因玉米的种植，但已批准了国外9个转基因玉米品系进口用作加工原料。随着转基因作物的广泛种植和商业化应用，转基因产品的安全性问题引起了公众的重视，许多国家和地区纷纷开始实施转基因标签制度，对转基因产品实施限量标识和进口，如欧盟设立了对转基因食品进行标识的最低含量阈值(0.9%)，即只有相关产品中转基因成分的含量高于这一阈值时才需标识。我国政府高度重视转基因生物的安全管理，颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理规章，对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度，且采用强制性标识方法，只要含有转基因成分就必须标识。转基因检测方法的建立是这些规章制度得以顺利实施的关键。迄今为止，我国已经研究和制定了多个转基因玉米的检测方法，并颁布为国家标准(如农业部869号公告-3-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法)。

2009年8月，我国批准了自主研发的转植酸酶基因玉米BVLA430101的生物安全证书。它是通过基因枪将黑曲霉中的植酸酶基因转入到玉米中，经过多代筛选培育而成的。转入植酸酶的目的是降解玉米中大量含有的植酸，释放可被动物利用的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本，减少动物粪、尿中磷的排泄，减轻环境污染，具有广阔的应用前景。尽管Chen等报道了转植酸酶基因玉米采用的启动子、终止子和目的基因的名称(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene.Transgenic Res.2008，17：633-643.)，但并没有提供确切的可以直接查询到的序列信息，也未提供启动子、目的基因和终止子之间的具体连接方式。对转基因检测来说，这些详细的信息对转基因材料的身份确认是必不可少的。2010年，谢家建等人报道了转植酸酶基因玉米BVLA430101完整表达框序列以及构建PCR方法（专利公开号为CN101792811A，公开日为2010年08年04）；同时他们揭示了该玉米品系转化体外源插入片段的5’端旁侧序列，并基于此序列信息建立了PCR定性检测方法（专利公开号为CN10172812A，公开日为2010年08年04）。但是，目前依然尚无关于定量方法检测转植酸酶基因玉米BVLA430101的报道或者专利。因此有必要建立一种新型转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR精确检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、灵敏、准确的检测转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现，本发明涉及一种转植酸酶基因玉米BVLA430101品系特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤1，合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，

下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所示荧光探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

步骤2，从转植酸酶基因玉米BVLA430101中提取出DNA并制备其稀释液；

步骤3，配制PCR反应体系，包括以下组分：所述正向引物、所述反向引物、所述荧光探针、10×Buffer、dNTPs、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、ddH₂O；

步骤4，将所述DNA稀释液加入到所述PCR反应体系中，采用定量PCR仪对所述DNA稀释液进行PCR扩增反应并检测。

优选的，步骤1中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。

优选的，步骤1中，所述上游引物、下游引物和荧光探针的浓度均为10μmol/L。