[发明专利]影响精子功能的唾液酸酶检测方法

权利要求书

1.影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

2.根据权利要求1所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的体外获能液为HSA 5mg/ml HTF。

3.根据权利要求1所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的第一步，按照下述步骤，分别进行精子唾液酸酶NEU1和NEU3的表达检测：

A 收集新鲜液化精液标本，离心分离出精子，PBS洗涤精子；

B 计数精子数量，冰上置20~30 min；

C 采用0.1%的Triton X-100对精子进行预处理，PBS洗涤精子，用3%的PFA再次对精子进行预处理；

D 当检测NEU1时，采用1%的BSA-PBS溶液进行封闭；或者，当检测NEU3时，采用甲醇固定；

E 采用1ug/ul的抗人NEU1抗体孵育1~3 h，PBS洗涤精子；

F 在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育1~2 h；

G 采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。

4.根据权利要求1所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的第二步，具体操作步骤如下：

A　收集新鲜液化精液标本，离心分离精子；

B　采用上游法，在5%的CO₂细胞培养箱中培养精子，收获上游精子，采用BWW培养液洗涤精子；

C　计数精子数量，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO₂细胞培养箱中孵育精子3~4 h；

D 先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液；

E 立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。

5.根据权利要求3或者4所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的A步骤，以500~600 g/min的速度低速离心5~6min。

6.根据权利要求4所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的B步骤，采用上游法于36~37 ℃，在5%的CO₂细胞培养箱中培养10~30 min。

7.根据权利要求4所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的C步骤，计数精子数量，调整为1×10⁷/ml以上。

8.根据权利要求4所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：所述的C步骤，用体外获能液HSA 5mg/ml HTF于36~37 ℃，5%的CO₂细胞培养箱中孵育3~4 h，反应体积100~200ul。

9.根据权利要求4所述的影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于： 所述的D步骤，先以500~600 g/min的速度低速离心5 ~6min，再以5000~6000g/min的速度低速离心10 ~15 min。