[发明专利]影响精子功能的唾液酸酶检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。 

背景技术

随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计：育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张(12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。 

多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能测定以上这些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研究已有一些进展, 但仍然存在很多尚未阐明的问题。 

临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析 Computer aided of semen analysis)，以及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，这仅仅是评价精子功能的一个方面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被揭示的因素。 

如文献“哺乳类动物精子自身的唾液酸酶参与获能过程中的唾液酸脱落”（Sialidases on mammalian sperm mediate deciduous sialylation during capacitation，《The Journal of Biological Chemistry》，2012 Nov 2;287(45):38073-9），首次报道了精子膜上的唾液酸酶（NEU1/3）是影响精子生殖能力的新因素。唾液酸(sialic acid)在小鼠及人的体外获能过程中以单个糖分子的方式从精子的细胞膜上脱落，而与此同时，精子膜上的唾液酸酶（NEU1/3）可能由于精子膜的流动性而脱落参与剪切致单个唾液酸分子脱落，文献证实了抑制NEU3的活性会降低精子的获能过程中磷酸化ErK的表达，以及少量不明原因性不育的病人精子这两种酶的低表达。 

文献虽然提出了唾液酸酶可用于评价精子功能，并公开了小鼠和少量人冰冻精子中唾液酸酶的检测方法。但文献只公开了唾液酸酶在精子中的表达检测，并没有对唾液酸酶的活性检测作进一步报道；并且，所公开的表达检测方法无法顺利检测出新鲜精子中的唾液酸酶，还不能适用于临床应用。 

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。  

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

所述的体外获能液为HSA (人血清白蛋白)5mg/ml HTF（人输卵管液）。 

所述的第一步，按照下述步骤，分别进行精子唾液酸酶NEU1和NEU3的表达检测： 

A 收集新鲜液化精液标本，低速离心分离出精子，PBS（磷酸缓冲液）洗涤精子，充分除去残留的精浆成分；

B 计数精子数量，冰上置20~30 min，用于制动精子，便于后续的操作；