[发明专利]鸭IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒，其特征在于，包括盒体(1)和隔离垫(2)，还包括IGF-I基因嵌合特异上下游引物(3)、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物(4)、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物(5)、IGF-I基因内对照DNA(6)、IGF-I R基因内对照DNA(7)、Tag酶DNA连接酶(8)。

2.一种权利要求1所述的鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

7)引物设计

通用引物的设计：

设计原则保证上下游引物的TM值≤58℃，通用引物的长度为18bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记；

嵌合特异引物的设计：

根据GenBank数据库中目标基因IGF-I和IGF-I R及参照基因ACTB基因的cDNA序列信息，设计了3对20～26bp长的序列作为嵌合特异引物，TM值≥61℃，扩增产物长度在200～310bp之间，相邻产物长度的差大于10bp，之后与通用引物组成嵌合特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，引物经Blast和Oligo mask软件分析，确保特异性扩增；

IGF-I基因嵌合特异上下游引物P1和P2、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物P3和P4、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物P5和P6，P1～P6六条引物详细信息如下，每条引物中小写ct前是通用引物，小写ct后为特异引物：

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’

IGF-I R基因嵌合特异上游引物P3表示的信息为：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为：

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为：

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’；

8)合成内对照DNA片段

针对IGF-I和IGF-I R基因和参照基因ACTB的扩增片段，合成与对应引物扩增序列相比插入3bp碱基的DNA片段为内对照序列，并进行精确定量，配制内对照DNA混合液，梯度稀释至10³～10⁴个分子／μl；

9)多重竞争性PCR反应

a)肝脏总RNA提取按TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒(DP421)的说明书进行，RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，OD_260／2801.8～2.0，保证RNA样品质量可靠，均一化RNA浓度至1μg／μl，取1μg总RNA，cDNA第1链的合成按照反转录试剂盒QuantScript RT Kit，KRl03-04的使用说明书进行；

b)配制PCR引物混合液，含3对0.5μM的嵌合特异引物P1、P2；P3、P4和P5、P6，20μM的通用引物，两者等比例混合；

c)多重PCR反应体系10×GT Buffer含34mM Mg²⁺1.5μl，100mM Mg²⁺0.09μl，dNTP mix各2.5mM3μl，Primers引物混合物3μl，Taq DNA Polymerase5units／μl0.75μl，Templates cDNA1.5μl，BSA10mg／ml0.21μl，内对照DNA1ul，DEPC H₂O补水至15μl，反应过程为94℃2min，94℃30s，62℃90s，65℃1min，20cycles；94℃2min，94℃30s，53℃90s，68℃1m，68℃20min，18cycles；

d)取1μl PCR产物，加入8.6μl的Hi-Di和0.4μl的DNA分子标准，上述混合物95℃，变性5min，然后迅速冰水浴2min，离心后用ABI测序仪3730检测，电泳结果经GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software v3.2软件分析获得每个基因位点的样本条带／内对照条带大小、峰高、峰面积的数据，产物大小由DNA分子标准得出，峰高或峰面积用于判断PCR产物的量；

4)数据分析

a)计算每个基因位点的比值S／内对照DNA条带I的荧光峰高或峰面积之比S／I；

b)将每个目标基因位点的比值S／I分别除以参照基因的比值S／I即获得样本目标基因的相对表达量。