[发明专利]鸭IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法。 

背景技术

我国是世界上最大的水禽生产国和消费国，但是我国水禽业整体生产水平不高，竞争力不强，水禽领域的技术很薄弱、可供利用的科学研究成果很少，特别是有关鸭肌肉生长发育分子技术方面的研究成果极少，因此，要想在短期内快速有效地提高我国鸭业生产水平，就必须借助先进的分子生物学的技术和成果，加快我国鸭业的发展。 

MCF-PCR技术是一种经济、较高通量、准确的多基因表达分析技术，该技术基于竞争性PCR原理，结合荧光通用引物和多重嵌合特异引物使用，实现多重PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离，对多个目标基因及参照基因进行同时定量，最后以参照基因校正即可获取目标基因的相对表达量。目前已经广泛应用于人类和动物基因表达检测研究。国内外大量的研究报道，IGF-I和IGF-I R基因在鸭生长发育调控过程中起重要作用。IGF-I和IGF-1R基因在组织中表达量的准确分析对IGF-I和IGF-I R基因的功能揭示和应用都有显著的科学和现实意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，将设计独特、稳定和高效的试剂盒与MCF-PCR技术结合，是一种可靠、便捷、价格低廉的检测方法。 

其具体技术方案为： 

一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒，包括盒体和隔离垫，还包括IGF-I基因嵌合特异上下游引物、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物、IGF-I基因内对照DNA、IGF-I R基因内对照DNA、Tag酶DNA连接酶。 

一种本发明所述的鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)引物设计 

通用引物的设计： 

设计原则保证上下游引物的TM值≤58℃，为了避免通用引物带来非特异产物，通用引物的长度为18bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记； 

嵌合特异引物的设计： 

根据GenBank数据库中目标基因IGF-I和IGF-I R及参照基因ACTB基因的cDNA序列信息，设计了3对20～26bp长的序列作为嵌合特异引物，TM值≥61℃，扩增产物长度在200～310bp之间，相邻产物长度的差大于10bp，之后与通用引物组成嵌合特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，引物经Blast和Oligo mask软件分析，确保特异性扩增； 

IGF-I基因嵌合特异上下游引物P1和P2、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物P3和P4、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物P5和P6，P1～P6六条引物详细信息如下，每条引物中小写ct前是通用引物，小写ct后为特异引物： 

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’ 

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异上游引物P3表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’； 

2)合成内对照DNA片段