[发明专利]一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法。

背景技术

治疗性抗体药物对其纯度有极高的要求，以保证其经注射手段对病患给药的安全性。对生物制药生产行业来说，以工业规模提纯药用级抗体的具有重大的经济效益。

抗体的纯化工艺一般来说是采用数个过滤及层析柱分离步骤，从细胞、不溶性物质和其它可溶的生化物质的混合物中分离所需的抗体。如深层过滤工艺可以高效经济地移除细胞、碎片或不溶性物质，经滤清处理的培养上清经过亲和层析及其他层析可以提纯得到抗体。

蛋白A基质的亲和层析常用于第一个纯化工艺步骤（从培养上清液选择性分离出所需抗体），然后进行离子交换层析（用来进一步精纯亲和层析所得的抗体，进一步移除残留的微量杂质，如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA及亲和层析柱的析出物）。就一般工艺而言，亲和层析及离子交换层析都需要不同的操作条件。此外，采用高盐缓冲液洗脱离子交换层析柱会将其它杂质随同抗体一同洗脱，这还经常涉及到耗时的缓冲液置换，使得工艺流程时耗过长并导致产品流失。

发明内容

本发明的目的是提供一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法。

本发明提供的第一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法，依次包括如下步骤：

（1）取可以分泌抗体的细胞的细胞培养上清；

（2）进行亲和层析；

（3）进行阳离子交换层析；

（4）进行阴离子交换层析；

其特征在于：每个层析步骤后不进行缓冲液的置换，直接进行下一个层析步骤。

所述步骤（1）和所述步骤（2）之间还包括过滤收集滤液的步骤。所述过滤收集滤液的具体方法为：先用孔径为0.6-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，然后用孔径为0.1μm以下（孔径需确保目的抗体可以穿过）的过滤器过滤并收集滤液。如果滤液中的抗体浓度低于3mg/mL，可用30kDa的超滤膜进行渗滤浓缩。本步骤可以得到抗体浓度为3-10mg/mL、pH6.5-7.5、浊度低于10NTU的溶液。

所述亲和层析中，采用蛋白A亲和层析基质，用pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。所述亲和层析中，柱床高度为15cm以上（如15-30cm)。所述亲和层析过程中，流速可为30-180cm/h。所述亲和层析过程中，上样后，可先用5倍以上柱床体积（如5-10倍柱床体积）的洗涤液(溶剂为水，含有20mM醋酸钠和150mM氯化钠；pH5.3-5.5)洗涤以去除杂质，然后用3倍以上柱床体积（如3-10倍柱床体积）的pH3.1-3.3的醋酸盐缓冲液（具体可为100mM醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液）洗脱以收集目标抗体，在线监测OD280,收集抗体峰（即0.025AU以上的部分），得到过柱后溶液。本步骤可以得到pH3.2-3.8,抗体浓度不超过20mg/mL的过柱后溶液。

所述步骤（2）和所述步骤（3）之间还包括对亲和层析收集的过柱后溶液调pH的步骤。具体可采用120-140mM醋酸盐水溶液（所述醋酸盐水溶液具体可为醋酸钠水溶液或醋酸钾水溶液）调节pH至5.0-5.2。在调pH前，可先将亲和层析收集的过柱后溶液室温(20-25℃)孵育60分钟以灭活病毒。在调pH后，可用0.22μm过滤器过滤并收集滤液。本步骤可以得到电导率为7-8mS/cm，抗体浓度为2-5mg/mL的溶液。

所述阳离子交换层析中，采用SP-Sepharose Fast Flow基质，用pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液洗脱以收集目标抗体。所述阳离子交换层析中，柱床高度为10cm以上（如10-30cm)。所述阳离子交换层析过程中，流速可为30-180cm/h。所述阳离子交换层析过程中，上样后，可先用5倍以上柱床体积（如5-10倍柱床体积）的pH5.5-5.7、60-80mM醋酸盐缓冲液（所述醋酸盐缓冲液可为醋酸钠缓冲液或醋酸钾缓冲液）洗涤以去除杂质，然后用5倍以上柱床体积（如5-10倍柱床体积）的pH7.4-7.6、30-50mM磷酸盐缓冲液（所述磷酸盐缓冲液可为磷酸钠盐缓冲液或磷酸钾盐缓冲液）洗脱以收集目标抗体，在线监测OD280,收集抗体峰（即0.025AU以上的部分），得到过柱后溶液。本步骤可以得到pH7.3-7.7,抗体浓度20mg/ml以下的过柱后溶液。