[发明专利]检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法

权利要求书

1.鸭MAPK1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种克隆鸭MAPK1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取鸭脾脏总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，MAPK1-AF和MAPK1-AR为引物，PCR扩增MAPK1基因；扩增产物回收后与pMD18-T载体连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为pMD18-MAPK1；上游引物MAPK1-AF和下游引物MAPK1-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

（2）提取鸭脾脏总RNA，用MAPK1-3GSP1和3’RACE Outer Primer进行Outer PCR反应，MAPK1-3GSP2和3’RACE Inner Primer进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’-pMD18-MAPK1；MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示，3’RACE Outer Primer和3’RACE Inner Primer核苷酸序列如SEQ ID NO.9和10所示；

（3）提取鸭脾脏总RNA，用MAPK1-5GSP1（SEQ ID NO.11）和5’RACE Outer Primer（SEQ ID NO.13）进行Outer PCR反应，MAPK1-5GSP2（SEQ ID NO.12）和5’RACE Inner Primer（SEQ ID NO.14）进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与pMD18-T连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为5’-pMD18-MAPK1；MAPK1-5GSP1和MAPK1-5GSP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.11和12所示，5’RACE Outer Primer和5’RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和14所示；

（4）将pMD18-MAPK1、3’-pMD18-MAPK1和5’-pMD18-MAPK1质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPK1的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种用于检测鸭MAPK1基因的遗传标记物，其特征在于，其核苷酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列或其特异性片段。

4.用于扩增权利要求3所述遗传标记物的引物。

5.如权利要求4所述引物，其特征在于，其上游引物MAPK1-TR-F和下游引物MAPK1-TR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示。

6.一种检测鸭MAPK1基因的方法，其特征在于，提取鸭组织总RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，利用SEQ ID NO.3和4所示的引物进行荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

7.如权利要求6所述的检测鸭MAPK1基因的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为：20μL反应体系的具体配置为：2×GoqPCR Master Mix10μL，上游引物MAPK1-TR-F和下游引物MAPK1-TR-R各0.5μL，cDNA1μL，去核酸水8μl。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。

9.含有权利要求4或5所述引物的试剂盒。

10.权利要求9所述的试剂盒在检测鸭MAPK1基因中的应用。