[发明专利]检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及鸭MAPK1基因及荧光定量检测该基因的方法。

背景技术

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种细胞过程。在哺乳动物细胞中已发现和克隆了ERK、JNK/SAPK、p38/RK和ERK5/BMK1四个MAPK亚族。这些MAPK能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要调控作用。不同MAPK亚族被其上游激酶激活后，可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和酶类等多种底物来调节多种细胞生理过程，包括炎症、应激、细胞生长、发育、分化、死亡和功能同步化等。MAPK亚族成员对下游蛋白激酶的磷酸化是发挥其生理作用的重要方式。丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)又称为细胞外信号调节激酶2(extracellular signal-regulated kinase2，ERK2)，其分子量为42KDa。

与人和哺乳动物相比，禽类MAPK1的研究相对滞后，目前只有关于鸡MAPK1的部分研究报道。鸭MAPK1基因未见报道，为研究鸭MAPK1在鸭发病过程中的作用以及其在鸭体内的表达水平，急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、自动化程度高等特点，现已被广泛地应用于分子生物学及医学等研究领域，发挥着重大作用。目前将荧光定量RT-PCR用于检测鸭MAPK1基因的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供鸭MAPK1基因的全基因序列。

本发明的另一目的在于提供一种快速检测鸭体内MAPK1表达水平的荧光定量RT-PCR方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）根据GenBank上发表的鸡MAPK1基因序列（登录号：NM_204150），用Primer Premier5.0软件设计上游引物MAPK1-AF和下游引物MAPK1-AR（核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示）。提取鸭脾脏总RNA，用Random Primer（由单链六聚体组成，六个碱基的随机组合，购自Promega公司）为反转录的引物，以RNA为模板合成cDNA。以cDNA为模板，MAPK1-AF/MAPK1-AR为引物，PCR扩增MAPK1基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析、回收。将回收的PCR产物通过连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为pMD18-MAPK1。

（2）使用3’full RACE Kit和5’full RACE Kit，根据RACE操作的要求，在测序正确的区域设计3’端和5’端特异性引物。提取鸭脾脏总RNA，按照3’full RACE Kit试剂盒说明书进行3’full RACE实验。用MAPK1-3GSP1（SEQ ID NO.7）和3’RACE Outer Primer（SEQ ID NO.9）进行Outer PCR反应，MAPK1-3GSP2（SEQ ID NO.8）和3’RACE Inner Primer（SEQ ID NO.10）进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’-pMD18-MAPK1。

（3）提取鸭脾脏总RNA，按照5’full RACE Kit试剂盒说明书进行5’full RACE实验。用MAPK1-5GSP1（SEQ ID NO.11）和5’RACE Outer Primer（SEQ ID NO.13）进行Outer PCR反应，MAPK1-5GSP2（SEQ ID NO.12）和5’RACE Inner Primer（SEQ ID NO.14）进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与pMD18-T连接，将连接产物转入DH5α感受态中，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPK1序列进行比较，测序正确的质粒命名为5’-pMD18-MAPK1。

（4）将pMD18-MAPK1、3’-pMD18-MAPK1和5’-pMD18-MAPK1质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPK1的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。