[发明专利]一种诱导川贝母胚状体产生的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种诱导川贝母胚状体产生的方法。

背景技术

川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，生长在海拔3500m~4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜荫蔽的特性。川贝母是重要的治疗咳嗽的良药，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状。川贝母植物生长在海拔2800-4700m的高山灌丛或草地中，主要依靠种子进行有性繁殖，但因其种子存在形态和生理后熟的特性，因此存在川贝母种苗培育难度大、栽种时间长和繁殖系数低等问题。

组织培养技术是一项重要的生物技术。当前川贝母组培技术都是通过利用川贝母的组织器官，选择在不同生长素和细胞分裂素配比的情况下，经过诱导愈伤组织、芽分化、芽增殖和生根等多个环节获得再生植株。如刘帆等人的《提高卷叶贝母植株再生率的研究》和高燕等人的《贝母愈伤组织的诱导及植株再生》研究。这种培养方法不仅存在诱导培养周期长、花费成本高的问题，而且也存在培养材料在长时间的培养过程中易发生细胞的变异，从而难以确保原物种的稳定性。而利用组织培养技术培育的胚状体具有与植物受精卵形成合子胚相似的结构，不仅能快速、大量地获得川贝母的再生植株，而且由于胚状体一般都是起源于单个细胞，因此，培育出的川贝母胚状体都具有遗传背景上的一致性，对于开展川贝母植物的细胞分化和形态建成过程中各种生理生化的变化，结构变化以及基因表达等有关问题的研究具有重要的意义。当前还未见有通过采用培育川贝母胚状体的方式获得再生植株的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种诱导川贝母胚状体产生的方法，该方法步骤简单，可操作性强，工艺稳定，适用于在工业化大生产中的广泛应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤：

S1：选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%～75%的酒精消毒30～60s，然后用浓度为0.1%～0.15%的升汞消毒4～10min，最后用无菌水震荡洗3～6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5～2.0mg·L^-1+2，4-D 1～2mg·L^-1+IAA 0.1～1mg·L^-1 +蔗糖20～60g·L^-1 +琼脂5.0～7.0 g·L^-1中进行培养，所采用的培养温度16～20℃、每天光照6～14h、光照强度为1000～2000lx的条件下诱导愈伤组织；

S2：选取经过S1步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5～2.5cm²，然后接入MS+头孢噻肟钠200～600mg·L^-1培养基中培养40～60天得到愈伤组织胚状体；

S3：将愈伤组织胚状体以1～3个为1组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1～1mg·L^-1+头孢噻肟钠100～450mg·L^-1中，所采用的培养温度为15～25℃、每天光照6～20小时、光照强度为800～2500lx的培养条件下培养50～60天后，得到川贝母小植株。

优选地，S1步骤中所述的外植体是位于茎基部端的幼嫩叶鞘。

优选地，S1步骤中所述的培养基为MS+6-BA 0.58mg·L^-1+2，4-D 1.5mg·L^-1+IAA 0.5 mg·L^-1 +蔗糖40g·L^-1 +琼脂6.0g·L^-1。

优选地，S1步骤中所述的培养温度为20℃、每天光照10h、光照强度为1500lx。

优选地，S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠200～600mg·L^-1，培养条件为温度15～22℃、每天光照8～16h、光照强度为1500～2500lx。

优选地，S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠400mg·L^-1，培养条件为温度18℃、每天光照12h、光照强度为1800lx的条件下培养50天。