[发明专利]定点突变获得的谷氨酸脱羧酶突变体基因及其编码蛋白质和应用

说明书

技术领域

本发明涉及两种谷氨酸脱羧酶突变体基因及其应用，属于分子生物学的技术领域。

背景技术

定点突变（site-directed mutagenesis）属于理性设计，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术（图2）。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定碱基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。

谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15）以PLP作为辅酶，催化谷氨酸发生不可逆的α-脱酸反应，过程中消耗一个质子，生成γ-氨基丁酸（γ-aminbutyric，简称GABA)。GAD广泛存在于动物、植物、微生物中，但是在它们的机体里面的功能各不相同。其中在动物中主要是产生GABA，一种中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系统可以抵抗多种压力，如骤然高温、缺氧、钙离子骤增等；在微生物中，特别是一些肠道细菌，如大肠杆菌、乳酸菌等，主要与机体耐酸机制有关，它们的最适pH一般在4～5，在此范围之外酶活力会大幅降低，尤其是当pH大于6时基本失去活性，这使得利用该酶生物合成GABA受到体系pH值的严重限制，因此需要拓宽GAD酶的pH作用范围，使其在偏中性条件下，仍具有较好的活性，解决谷氨酸脱羧酶催化GABA生物合成时，在pH5.5～6.5时，催化能力低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成GABA创造好的条件。

发明内容

本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突变为中性氨基酸。

所述谷氨酸脱羧酶突变体为第312位谷氨酸突变为丝氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

所述谷氨酸脱羧酶突变体为第91位谷氨酸突变为谷氨酰胺，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。

本发明还提供了一种获得所述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于：在中国专利CN201110020606.8中公布的gadB1基因序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点分别为第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。

上述任一突变体基因及其所编码的酶在生物合成GABA的应用均属于本发明要求保护的范围。

本发明还提供一种生产上述谷氨酸脱羧酶突变体的方法，将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因gadB1^E312S和gadB1^E91Q的高效表达。

本发明中表达单元的启动子为常用的T7启动子，在T7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。

本发明所用的谷氨酸脱羧酶的基因gadB1来自产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2010367，分类学命名短乳杆菌Lb85（Lactobacillus brevis Lb85），gadB1的测序结果在中国专利CN201110020606.8中已经公布，序列见SEQ ID NO.5。

本发明提供的突变体酶在偏中性条件下，酶活有明显的提高，解决了野生型的谷氨酸脱羧酶在偏中性pH条件下催化活性低的问题，为利用该酶催化GABA生物合成创造好的条件。

本发明通过比较野生酶GadB1和突变酶GadB1^E312S、GadB1^E91Q的有效作用pH范围和体外的催化能力，结果发现在pH6.5下，突变体酶GadB1^E91Q将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的5.7倍；突变体酶GadB1^E312S将L-谷氨酸转变成GABA的转化率为野生型的3.6倍。

附图说明

图1为重组质粒pET28a(+)-gadB1的构建图谱：