[发明专利]番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种番木瓜环斑病毒基因，其特征在于：所述番木瓜环斑病毒基因为CP、Hc-Pro、NIb基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的番木瓜环斑病毒基因的RNAi表达载体的构建方法，其特征在于：是以感染番木瓜环斑病毒番木瓜叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的CP基因、Hc-Pro基因、NIb基因为模板，设计特异性引物，用高保真Taq酶进行PCR反应，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分别引入XhoI和BglII酶切位点，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分别引入BamHI和SalI酶切位点，引物序列如下：

CP正向序列：酶切位点XhoI和BglII

PRSV-CP-RNAi-P1:5’-CCCTCGAGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3’

PRSV-CP-RNAi-P2:5’-GAAGATCTTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3’

基因大小544bp

CP反向序列：酶切位点SalI和BamHI

PRSV-CP-RNAi-P3:5’-GCGTCGACTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3’

PRSV-CP-RNAi-P4:5’-CGGGATCCTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3’

Hc-Pro正向序列：酶切位点XhoI和BglII

PRSV-Hcpro-RNAi-P1:5’-CCCTCGAGTGAATGCACGTAACATGAACGA-3’

PRSV-Hcpro-RNAi-P2:5’-GAAGATCTACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3’

基因大小484bp

Hc-Pro反向序列：酶切位点SalI和BamHI

PRSV-Hcpro-RNAi-P3:5’-GCGTCGACTGAATGCACGTAACATGAACGA-3’

PRSV-Hcpro-RNAi-P4:5’-CGGGATCCACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3’

NIb正向序列：酶切位点XhoI和BglII

PRSV-NIb-RNAi-P1:5’-CCCTCGAGCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3’

PRSV-NIb-RNAi-P2:5’-GAAGATCTACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3’

基因大小424bp

NIb反向序列：酶切位点SalI和BamHI

PRSV-NIb-RNAi-P3:5’-GCGTCGACCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3’

PRSV-NIb-RNAi-P4:5’-CGGGATCCACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3’

将PCR产物连接到PMD18-T Simple载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由XhoI和BglII双酶切得到的CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段，与XhoI和BglII双酶切的pRNAi1017连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经BamHI和SalI双酶切与CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段进行连接，转化，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，经PstI和SalI双酶切与pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体同样双酶切后进行连接，转化，筛选阳性克隆子，电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP正反-OCS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro正反-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb正反-OCS构建成功。