[发明专利]番木瓜环斑病毒基因及其RNAi表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种番木瓜环斑病毒（PRSV）中外壳蛋白基因（CP）、辅助成分蛋白（HC-Pro）、复制酶基因（NIb）基因、保守序列分析和RNAi表达载体构建方法，RNAi植物表达载体可用于基因枪或农杆菌介导的遗传转化，创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。

背景技术

番木瓜(Carica papaya L.)的主要用途是生产水果和具有商业价值的蛋白水解酶。它是少有的能全年挂果，并在栽培9个月后就能结出成熟果实的作物。番木瓜树能存活25年或更长的时间，每个叶腋都能不断的抽生一个或多个果实，每个果实含有约1000多粒种子。从雄花或两性花采的花粉，很容易人工授粉到雌花或两性花。周年开花结果的习性，以及易于人工杂交，使得番木瓜能产生大量的后代和取得相当可靠的遗传转化结果，因此番木瓜是遗传/基因组研究和作物改良的一个有吸引力的模型。

1998年夏威夷转基因番木瓜彩虹和日升品种被开始商业化应用，是众所周知的科学突破，代表了第一次实际应用的转基因水果作物。利用基因枪法从最初转化夏威夷温和毒株HA5-1链的CP基因转基因株系中筛选出的转基因品种具有抗夏威夷PRSV的能力。之后，许多研究小组利用农杆菌介导法进行了大量转化工作，利用的外植体包括叶片、叶柄等，但最常用的是体胚发生的再生体系。番木瓜最高的转化效率是利用碳化硅或钨处理胚性愈伤，使愈伤受伤后再进行共培养得到的，卡那霉素抗性转化系（一般在150毫克/升）的筛选在6至13个月内完成，再生植株一般只有一个插入位点。近年，转抗真菌基因的番木瓜抗棕榈疫霉种质已通过基因枪的方法得到。当转基因育种技术的管制放宽后，转基因番木瓜系将成为世界范围内番木瓜产业增长的重要因素。

由PRSV-CP基因介导的抗性具有一定的广谱性，尤其是转各株系CP基因的通读部分的植株，对同属病毒均表现出一定的抗性，这是利用CP基因的优势所在。但应用上还有很大的局限性：PRSV-CP介导的抗性主要表现在病毒侵染早期、推迟发病和减轻症状,抗性水平较低；转基因表达的CP能包被异源病毒RNA，从而使得原本不能蚜传的病毒能够被蚜虫传播(Dougherty,1994)，或者一种病毒CP基因的植物表达产物可能包装另一种病毒或其他致病因子的基因组，从而形成一种新的致病因子(高艳梅等，2009)。

利用PRSV的复制酶（NIb）基因构建人工抗性基因转化植物获得抗病毒植株，是抗PRSV番木瓜生物技术育种的又一重要进展。早在1996、1998年我国中山大学和香港大学的研究人员就对番木瓜PRSV的复制酶基因进行了克隆和转化番木瓜的研究(叶长明等，1996；陈谷，1998)。我国华南农业大学的研究人员将番木瓜PRSV-Ys株系的复制酶基因转化入番木瓜中，转化植株对PRSV的Ys、Vb、Sm株系表现高抗，在定植田间的9个月中，转基因植株无一发病，而对照则全部发病。这一转基因品种“华农1号”于2006年获政府批准在广东省商业化种植。该复制酶基因含有35S启动子和一个NOS终止子，并具卡那霉素抗性筛选功能。据报道，华农1号能抗来自中国4个不同地区的番木瓜环斑病毒株系(阮小蕾等，2004；阮小蕾等，2009；阮小蕾等，2010)。之前，华南农业大学的研究者们尝试利用双元载体pBI121将不可译的复制酶基因和外壳蛋白基因转入番木瓜中，但转化植株没有获得抗病性。转PRSV-NIb基因的植株的抗性特点是：抗性强、专一、持续时间长、但抗性范围狭窄，一般对提供复制酶基因的亲本病毒株系有很强抗性,而对那些与亲本株系同源性差的病毒株系不表现抗性。

台湾番木瓜转基因研究者发现当PRSV-YK株系的Hc-Pro基因改变后，抗PRSV-YK株系的转基因种质将失去抗病能力（Ying-Huey Cheng，1996），这说明Hc-Pro基因在PRSV感染过程中发挥着重要作用，沉默病毒的Hc-Pro基因表达也是值得尝试的转基因育种策略。