[发明专利]一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，以怀地黄无菌苗初展开叶片去叶脉后剪成的叶盘作为根癌农杆菌感染的受体，经农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤诱导、抗性芽分化、抗性芽生根，最终获得地黄的转基因植株。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，叶盘被农杆菌侵染后先接种在无筛选抗生素的培养基上共培养48-72 h，之后接种到含有潮霉素或卡那霉素的筛选培养基上获得抗性愈伤和抗性芽，再把抗性芽接种到增殖培养基上增殖，在生根培养基上生根，获得转基因地黄植株。

3.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，怀地黄无菌苗的准备如下：将田间挖取的直径1-2 cm的怀地黄块根洗净，依次用酒精和HgCl₂消毒，之后用无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成长1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次。

4.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，根癌农杆菌菌株的活化与侵染菌液的制备如下：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h；挑取单克隆菌落接种到20-30 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h；取100 μL上述菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD₆₀₀=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD₆₀₀=0.5获得侵染菌液待用。

5.如权利要求4所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，所述的YEB液体培养基为：YEB基本培养基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50 mg/L+蔗糖5 g/L；所述的YEB固体培养基还含有琼脂粉15 g/L；所述的侵染培养基为：MS基本培养基+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L。

6.如权利要求5所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的叶盘，置于制备好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到无筛选抗生素的培养基上暗培养，所述的培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。

7.如权利要求6所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，共培养48-72 h后的叶盘转接到含抗生素的筛选培养基上，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，2周后更换一次培养基，3-4周后把长出的抗性愈伤转接到新的筛选培养基上，2-3周长出抗性芽；所述含抗生素的筛选培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+ 潮霉素 10-15 mg/L或卡那霉素50-75 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。

8.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，将长2-3 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，进行抗性芽扩繁；把长2-3 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中诱导生根；所述的丛生芽分化培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤0.2 mg/L+α-萘乙酸0.01 mg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L；所述的生根培养基为：MS基本培养基+α-萘乙酸0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。